日本血吸蟲(chóng)高遷移率族蛋白(SjHMGB1)免疫生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、日本血吸蟲(chóng)病是一種危害嚴(yán)重的人畜共患疾病，對(duì)人類(lèi)健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展存在不利影響。高效、安全的抗血吸蟲(chóng)病疫苗的研制是實(shí)現(xiàn)控制、消滅血吸蟲(chóng)病的有效途徑。輻照致弱血吸蟲(chóng)尾蚴和童蟲(chóng)疫苗（RAV)能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高保護(hù)性效應(yīng)，但不適于直接應(yīng)用，所以通過(guò)模擬RAV誘導(dǎo)的高保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制研發(fā)安全可靠的疫苗可能是解決血防難題的策略之一，而RAV免疫原性分子和細(xì)胞基礎(chǔ)及機(jī)制的研究是探索RAV高保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制的切入點(diǎn)之一。
　　RAV免疫可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生

2、以Th1為優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答的抗攻擊感染效果，而正常尾蚴則不能誘導(dǎo)這種保護(hù)性效應(yīng)。宿主對(duì)RAV的應(yīng)答模式可能與蟲(chóng)體特征性抗原表達(dá)及宿主特征性的先天和獲得性免疫應(yīng)答相關(guān)。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種保守的內(nèi)源性核內(nèi)蛋白，在受到某些刺激后，HMGB1分子可以轉(zhuǎn)到細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)作用。多項(xiàng)研究表明，HMGB1與宿主感染性免疫反應(yīng)有關(guān)，可以介導(dǎo)宿主樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)成熟和誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1型極化。因此，我們推測(cè)在RAV模型中，蟲(chóng)體細(xì)胞的凋

3、亡壞死及蟲(chóng)源性HMGB1應(yīng)急分子等在誘導(dǎo)高保護(hù)性效應(yīng)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。因此，本研究初步比較了SjHMGB1在正常日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體內(nèi)的分布情況;對(duì)SjHMGB1活化小鼠DCs成熟的免疫原性特征進(jìn)行了初步研究;初步分析了體外培養(yǎng)不同發(fā)育階段的童蟲(chóng)的凋亡和壞死情況，為進(jìn)一步闡述SjHMGB1在RAV中的免疫生物學(xué)功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　首先，運(yùn)用常規(guī)分子克隆技術(shù)，將目的片段SjHMGB1插入到pET28a(+)，并在原核表

4、達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)重組蛋白。利用重組蛋白免疫BALB/c小鼠制得免疫原性良好的多克隆SjHMGB1抗血清，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法，觀察SjHMGB1在不同發(fā)育階段的蟲(chóng)體組織中的定位，發(fā)現(xiàn)在7d、10d、14d、23d、32d和42d中均有分布，初步推斷其在童蟲(chóng)及雄性成蟲(chóng)的睪丸中表達(dá)量略高。
　　采用Bac-to-Bac桿狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制各無(wú)內(nèi)毒素(LPS)干擾的SjHMGB1蛋白。間接免疫熒光法檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組穿梭質(zhì)粒的昆蟲(chóng)細(xì)胞(

5、sf9)，將純化蛋白進(jìn)行WesternBlot分析其免疫原性，并進(jìn)一步利用TOP-TOP方法進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。結(jié)果表明我們成功在sf9細(xì)胞中表達(dá)了SjHMGB1蛋白，且具有良好的免疫原性。
　　為驗(yàn)證SjHMGB1是否能夠活化宿主樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)，參與宿主免疫炎癥反應(yīng)，制備無(wú)菌小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDCs)，與真核表達(dá)的sjHMGB1純化蛋白共孵育，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)DCs表面標(biāo)志CD40、CD80、CD86和MH

6、CⅡ的表達(dá)量，分析DCs的表型成熟情況。結(jié)果表明，DCs表面的CD40、CD80、CD86和MHCⅡ均呈上調(diào)表達(dá)，初步表明SjHMGB1可以促進(jìn)BMDCs的表型成熟，為后續(xù)的功能成熟實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　為了解RAV誘導(dǎo)宿主高保護(hù)力與血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體細(xì)胞凋亡壞死的關(guān)系，我們對(duì)不同時(shí)期的正常和RA尾蚴體外轉(zhuǎn)化童蟲(chóng)的凋亡壞死情況進(jìn)行了初步分析。分別收集RA與正常尾蚴，體外機(jī)械斷尾轉(zhuǎn)化為童蟲(chóng)，體外分別培養(yǎng)4d、7d、10d和14d，分別運(yùn)用透射

7、電鏡(TEM)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)觀察蟲(chóng)體超微形態(tài)變化及檢測(cè)蟲(chóng)體細(xì)胞的凋亡情況。TEM結(jié)果顯示，正常組和輻照組間蟲(chóng)體形態(tài)早期(4d)未呈現(xiàn)明顯差異變化;經(jīng)7d至14d時(shí)正常蟲(chóng)體呈現(xiàn)逐漸凋亡壞死的表型變化，而輻照組蟲(chóng)體則呈現(xiàn)出更加明顯的壞死表型變化。FCM結(jié)果表明，體外培養(yǎng)第4d，正常組凋亡比例較輻照組高;經(jīng)7d、10d至14d時(shí)，RA組蟲(chóng)體細(xì)胞的凋亡壞死迅速增加，而正常組蟲(chóng)體細(xì)胞的凋亡壞死則逐漸增強(qiáng)。即正常和RA蟲(chóng)體呈現(xiàn)出不同的凋亡壞

8、死變化模式。為進(jìn)一步研究RAV模型誘導(dǎo)高保護(hù)力的細(xì)胞機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　總之，我們分別獲得了SjHMGB1的原核蛋白和真核蛋白，觀察到SjHMGB1在7d、10d、14d、23d、32d和42d的日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體中均有表達(dá)，初步明確SjHMGB1可以促進(jìn)小鼠BMDC的表型成熟，并且從蟲(chóng)體形態(tài)學(xué)和細(xì)胞水平檢測(cè)到正常和RA蟲(chóng)體呈現(xiàn)出不同的凋亡壞死變化模式，為進(jìn)一步闡述SjHMGB1及蟲(chóng)體細(xì)胞的凋亡壞死情況在RAV免疫生物學(xué)功能和機(jī)制奠