日本血吸蟲高遷移率族蛋白(SjHMGB1)免疫生物學功能的初步研究.pdf

1、日本血吸蟲病是一種危害嚴重的人畜共患疾病，對人類健康和社會經(jīng)濟發(fā)展存在不利影響。高效、安全的抗血吸蟲病疫苗的研制是實現(xiàn)控制、消滅血吸蟲病的有效途徑。輻照致弱血吸蟲尾蚴和童蟲疫苗（RAV)能誘導宿主產生高保護性效應，但不適于直接應用，所以通過模擬RAV誘導的高保護性效應機制研發(fā)安全可靠的疫苗可能是解決血防難題的策略之一，而RAV免疫原性分子和細胞基礎及機制的研究是探索RAV高保護性效應機制的切入點之一。
　　RAV免疫可誘導宿主產生

2、以Th1為優(yōu)勢免疫應答的抗攻擊感染效果，而正常尾蚴則不能誘導這種保護性效應。宿主對RAV的應答模式可能與蟲體特征性抗原表達及宿主特征性的先天和獲得性免疫應答相關。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種保守的內源性核內蛋白，在受到某些刺激后，HMGB1分子可以轉到細胞外發(fā)揮生物學作用。多項研究表明，HMGB1與宿主感染性免疫反應有關，可以介導宿主樹突狀細胞(DCs)成熟和誘導T細胞向Th1型極化。因此，我們推測在RAV模型中，蟲體細胞的凋

3、亡壞死及蟲源性HMGB1應急分子等在誘導高保護性效應方面發(fā)揮了關鍵作用。因此，本研究初步比較了SjHMGB1在正常日本血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體內的分布情況;對SjHMGB1活化小鼠DCs成熟的免疫原性特征進行了初步研究;初步分析了體外培養(yǎng)不同發(fā)育階段的童蟲的凋亡和壞死情況，為進一步闡述SjHMGB1在RAV中的免疫生物學功能和機制奠定基礎。
　　首先，運用常規(guī)分子克隆技術，將目的片段SjHMGB1插入到pET28a(+)，并在原核表

4、達系統(tǒng)中成功表達重組蛋白。利用重組蛋白免疫BALB/c小鼠制得免疫原性良好的多克隆SjHMGB1抗血清，運用免疫組織化學方法，觀察SjHMGB1在不同發(fā)育階段的蟲體組織中的定位，發(fā)現(xiàn)在7d、10d、14d、23d、32d和42d中均有分布，初步推斷其在童蟲及雄性成蟲的睪丸中表達量略高。
　　采用Bac-to-Bac桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)制各無內毒素(LPS)干擾的SjHMGB1蛋白。間接免疫熒光法檢測轉染重組穿梭質粒的昆蟲細胞(

5、sf9)，將純化蛋白進行WesternBlot分析其免疫原性，并進一步利用TOP-TOP方法進行蛋白質譜分析。結果表明我們成功在sf9細胞中表達了SjHMGB1蛋白，且具有良好的免疫原性。
　　為驗證SjHMGB1是否能夠活化宿主樹突狀細胞(DCs)，參與宿主免疫炎癥反應，制備無菌小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(BMDCs)，與真核表達的sjHMGB1純化蛋白共孵育，流式細胞術(FCM)測DCs表面標志CD40、CD80、CD86和MH

6、CⅡ的表達量，分析DCs的表型成熟情況。結果表明，DCs表面的CD40、CD80、CD86和MHCⅡ均呈上調表達，初步表明SjHMGB1可以促進BMDCs的表型成熟，為后續(xù)的功能成熟實驗奠定基礎。
　　為了解RAV誘導宿主高保護力與血吸蟲蟲體細胞凋亡壞死的關系，我們對不同時期的正常和RA尾蚴體外轉化童蟲的凋亡壞死情況進行了初步分析。分別收集RA與正常尾蚴，體外機械斷尾轉化為童蟲，體外分別培養(yǎng)4d、7d、10d和14d，分別運用透射

7、電鏡(TEM)和流式細胞術(FCM)觀察蟲體超微形態(tài)變化及檢測蟲體細胞的凋亡情況。TEM結果顯示，正常組和輻照組間蟲體形態(tài)早期(4d)未呈現(xiàn)明顯差異變化;經(jīng)7d至14d時正常蟲體呈現(xiàn)逐漸凋亡壞死的表型變化，而輻照組蟲體則呈現(xiàn)出更加明顯的壞死表型變化。FCM結果表明，體外培養(yǎng)第4d，正常組凋亡比例較輻照組高;經(jīng)7d、10d至14d時，RA組蟲體細胞的凋亡壞死迅速增加，而正常組蟲體細胞的凋亡壞死則逐漸增強。即正常和RA蟲體呈現(xiàn)出不同的凋亡壞

8、死變化模式。為進一步研究RAV模型誘導高保護力的細胞機制奠定了基礎。
　　總之，我們分別獲得了SjHMGB1的原核蛋白和真核蛋白，觀察到SjHMGB1在7d、10d、14d、23d、32d和42d的日本血吸蟲蟲體中均有表達，初步明確SjHMGB1可以促進小鼠BMDC的表型成熟，并且從蟲體形態(tài)學和細胞水平檢測到正常和RA蟲體呈現(xiàn)出不同的凋亡壞死變化模式，為進一步闡述SjHMGB1及蟲體細胞的凋亡壞死情況在RAV免疫生物學功能和機制奠