日本血吸蟲(chóng)TOR基因克隆表達(dá)及生物學(xué)功能研究.pdf

1、血吸蟲(chóng)病仍然是一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，數(shù)以?xún)|計(jì)的人受其威脅。環(huán)境治理和藥物干預(yù)是當(dāng)前防控的主要措施。研發(fā)高效、安全的疫苗是血吸蟲(chóng)病持續(xù)控制的研究方向之一。宿主補(bǔ)體是宿主免疫殺傷寄生蟲(chóng)的重要效應(yīng)因子，血吸蟲(chóng)可以通過(guò)一些自身蛋白調(diào)節(jié)宿主補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)而逃避宿主的免疫攻擊。血吸蟲(chóng)體被表膜中具抑制補(bǔ)體功能的蛋白有可能成為疫苗候選分子。四跨膜孤兒受體(TOR)是一種多跨膜受體蛋白，具有補(bǔ)體C2結(jié)合位點(diǎn)，可抑制C3轉(zhuǎn)化酶的形成而調(diào)節(jié)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)。曼氏

2、血吸蟲(chóng)TOR(SmTOR)的研究表明，該分子能誘導(dǎo)較高的保護(hù)效果。本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期日本血吸蟲(chóng)體被表膜蛋白質(zhì)組研究結(jié)果，開(kāi)展了日本血吸蟲(chóng)TOR(SjTOR)蛋白特性和生物學(xué)功能研究。
　　根據(jù)SjTOR參考序列，設(shè)計(jì)引物應(yīng)用PCR克隆得到SjTOR基因片段，長(zhǎng)度為1245 bps，編碼414個(gè)氨基酸，比對(duì)分析顯示與SmTOR、埃及血吸蟲(chóng)TOR(ShTOR)、錐蟲(chóng)TOR相似性分別為77.0％、72.0％、和75.0％。序列分析顯示，

3、SjTOR不含信號(hào)肽，具有5個(gè)N糖基化位點(diǎn):跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，SjTOR包含四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，SjTOR在蟲(chóng)體發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有轉(zhuǎn)錄，在尾蚴時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平最高，在雌蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄明顯高于雄蟲(chóng)。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SjTOR主要分布于蟲(chóng)體的表膜，在實(shí)質(zhì)組織也有分布。
　　根據(jù)SjTOR第一個(gè)膜外區(qū)(SjTOR-ed1，AA47-168)序列設(shè)計(jì)合成引物，構(gòu)建含SjTOR第一個(gè)膜外區(qū)(SjTOR-ed1)基因的重組表達(dá)

4、質(zhì)粒pET-28a-SjTOR-ed1，在BL21（DE3）大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并用組蛋白親和層析純化獲得重組蛋白rSjTOR-ed1，分子量約為14 kDa。Western blot結(jié)果表明重組蛋白rSjTOR-ed1具有良好的免疫原性。用重組蛋白rSjTOR-ed1免疫小鼠，在兩次獨(dú)立的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中分別獲得了24.51％和26.51％的減蟲(chóng)率及39.62％和32.92％的肝臟減卵率。ELISA結(jié)果表明重組蛋白rSjTOR-ed1能夠誘

5、導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性IgG抗體，抗體亞型分析結(jié)果顯示，免疫重組蛋白rSjTOR-ed1能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG1和IgG2a抗體，且IgG1與IgG2a的比值在第4周達(dá)到最高后逐漸下降。
　　溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛋白rSjTOR-ed1能抑制補(bǔ)體溶血且在濃度為0.2～1.0μM之間時(shí)其補(bǔ)體抑制作用呈劑量依賴(lài)性，蛋白濃度為10μM時(shí)的溶血抑制率可達(dá)60.26％。補(bǔ)體C2結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛋白rSjTOR-ed1可與補(bǔ)體C2結(jié)合

6、。根據(jù)SjTOR基因序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)特異的siRNAs，應(yīng)用浸泡法對(duì)體外培養(yǎng)的童蟲(chóng)SjTOR進(jìn)行干擾，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，4對(duì)siRNAs對(duì)TOR基因的轉(zhuǎn)錄分別產(chǎn)生了45.12％、38.05％、25.46％、44.25％的干擾效果。
　　綜上，本文成功克隆了SjTOR基因，查明其在日本血吸蟲(chóng)尾蚴中轉(zhuǎn)錄水平較高，主要表達(dá)分布在血吸蟲(chóng)體被，并在大腸桿菌中表達(dá)純化到含其ed1的重組蛋白rSjTOR-ed1