日本血吸蟲信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白SjWnt4、SjWnt10a編碼基因的克隆、表達(dá)及其生物學(xué)功能分析.pdf

1、血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的分布廣泛、危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病.血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體呈現(xiàn)不同的基因差異表達(dá)模式,導(dǎo)致血吸蟲獨(dú)特的代謝和發(fā)育過程及顯著的生物學(xué)和形態(tài)學(xué)變化.由Wnt基因家族產(chǎn)物與其它相關(guān)基因產(chǎn)物所構(gòu)成的Wnt信號通路,是細(xì)胞發(fā)育和生長調(diào)節(jié)的一個關(guān)鍵途徑,對動物的發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用.本研究在日本血吸蟲性別、期別差異蛋白質(zhì)組研究的基礎(chǔ)上,首次克隆了2個編碼信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Wnt的基因,并對這兩個基因進(jìn)行了表達(dá)及生物學(xué)功能研

2、究. 作者首先利用本實驗室在雙向電泳結(jié)合肽質(zhì)量指紋圖譜分析基礎(chǔ)上獲得的1個Wnt家族蛋白的一段肽序列,以此肽序列為詢問序列在日本血吸蟲EST庫中搜索到2個日本血吸蟲的相應(yīng)EST片段(GenBank登錄號AAM89872、AY811118).根據(jù)EST序列,利用RACE技術(shù)首次克隆獲得日本血吸蟲信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Wnt4編碼基因研wnt4(GenBank登錄號DQ643829)和Wnt10a編碼基因Sjwnt10a(GenBank登錄號

3、DQ643830). 生物信息學(xué)分析表明這兩個基因編碼的蛋白質(zhì)具有十分典型的Wnt家族蛋白特征:整個蛋白序列中散在著100多個Wnt家族蛋白的保守位點;有23～24個可交連形成二硫鍵的保守的半胱氨酸殘基,其中50﹪位于蛋白的羧基端;具有三個或四個糖基化位點.序列分析表明研wnt4基因的ORF含1311bp,編碼436個氨基酸,理論分子量49.6kD,該基因編碼的氨基酸序列與日本三角渦蟲的Wnt4相似性達(dá)43﹪,與人Wnt4的相似

4、性為37﹪.實時定量PCR分析顯示該基因在14天童蟲、19天童蟲、31天成蟲、44天雌蟲及44天雄蟲中均有表達(dá),其中19天童蟲中的表達(dá)量明顯高于其它發(fā)育階段,44天雌蟲中的表達(dá)量明顯高于雄蟲.成功構(gòu)建了該基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-Sjwnt4,應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá),重組蛋白以包涵體形式存在,分子量為76kD,Westem blotting顯示表達(dá)產(chǎn)物能被日本血吸蟲成蟲抗原免疫兔血清所識別,具有良好的抗原性.Sjwnt1

5、0a基因的ORF含1896bp,編碼631個氨基酸,理論分子量73.3kD.該基因編碼的氨基酸序列與人、鼠的Wnt10a的氨基酸序列相似性都為26﹪.實時定量PCR分析顯示該基因在日本血吸蟲19天童蟲中表達(dá)量最高,在14天童蟲和44天雄蟲中也有表達(dá),但分別僅為19天童蟲表達(dá)量的8.8﹪和5﹪,而在31天成蟲和44天雌蟲中沒有檢測到該基因. 本文利用RNAi技術(shù)對Sjwnt4基因表達(dá)進(jìn)行了初步地探索,成功篩選出具有較高干擾效果的s

6、iRNA小分子S499,抑制率達(dá)到86.4﹪,為后續(xù)試驗打下基礎(chǔ).應(yīng)用重組蛋白rsjWnt4.免疫BALB/c小鼠,獲得了19.90﹪的減蟲率和20.58﹪的肝組織減卵率. 本論文率先開展了血吸蟲信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Wnt的研究,首次獲得兩個編碼信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Wnt的基因,發(fā)現(xiàn)這兩個基因在童蟲期高表達(dá);成功將Sjwnt4在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá),在小鼠中初步評估了重組蛋白誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果;成功篩選出對Sjwnt4基因具有干擾作用的siRN