日本血吸蟲Mago nashi基因的克隆、表達與功能鑒定.pdf

1、血吸蟲病目前仍是危害人畜健康的重要公共衛(wèi)生問題之一。在我國，日本血吸蟲病雖經(jīng)數(shù)十年防治，投入大量人力和財力，疫情仍時有反復，防治效果難以鞏固。血吸蟲致病主要由于性成熟成蟲所產的蟲卵在人畜肝臟大量沉積形成蟲卵肉芽腫，另一方面，沉積在腸壁的蟲卵排出體外是造成該病流行傳播的重要途徑。因此，控制血吸蟲性別分化、性成熟及雌蟲產卵成為防制血吸蟲病的重要策略，其中血吸蟲性別特異性表達產物及功能研究，對血吸蟲生殖發(fā)生與發(fā)育的深入了解及抗血吸蟲新藥研制都

2、有重要實際意義。RNA干擾(RNAi)技術作為一項新技術以其高特異性、高效性、成本低廉等優(yōu)點目前已經(jīng)運用于血吸蟲基因功能的研究。我們選擇從本室建立的日本血吸蟲童蟲cDNA文庫中篩選出的與模式生物調節(jié)雌雄同體性別決定蛋白即決定生殖細胞雄性化作用的Mago nashi樣蛋白基因(Genebank登錄號BM735619)作為靶基因，構建表達小發(fā)夾RNA(shRNA)質粒pSUPER的RNAi系統(tǒng)，為運用RNAi技術鑒定該基因在日本血吸蟲性別發(fā)

3、育和生殖功能奠定基礎。 根據(jù)日本血吸蟲Mago nashi樣蛋白基因(序列號為BM735619)作為shRNA的目的基因，利用 www．ambion．com/techlib/misc在線軟件獲得目的序列，經(jīng)BLAST分析無同種屬物種同源序列，分別選取第193-211堿基序列為M1及第464-482堿基序列為M2的特異針對日本血吸蟲Mago nashi樣蛋白基因序列。陰性對照根據(jù)M1編碼序列隨機重排并經(jīng)BLAST分析無同種屬物種同

4、源性序列的1對堿基序列為R。在shRNA兩端分別加上 BglⅡ和HindⅢ的酶切位點，選取的特異堿基序列與其互補序列之間連以9個核苷酸環(huán)，每條鏈shRNA核苷酸為64個。正向序列：GATCCCC N19 TTCAAGAGA N’19 TTTTTGGAAA，反向序列：AGCTTTTCCAAAAA N19TCTCTrGAA N’19 GGG，其中N19即所選特異堿基正向序列，N’19即其反向序列。將設計好的6條寡核苷酸序列交由生物技術公司合

5、成。合成后寡核苷酸通過退火形成雙鏈DNA片段，將其與經(jīng)限制性內切酶BgIⅡ和HindⅢ雙酶切的pSUPER質粒連接，構建表達shRNA的重組質粒。由于重組質粒BglⅡ酶切位點喪失，我們選擇HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切鑒定?？召|粒經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后被切下的小片段應為227bp，而重組質粒因插入64bp則被切下的小片段應為291bp。經(jīng)酶切及測序證實pSUPER構建成功后，純化重組pSUPER。在BTX電穿孔儀上，經(jīng)預實驗后確

6、定參數(shù)為120V電壓、20ms脈沖時值、1次脈沖次數(shù)，將RNAi質粒電穿孔轉染機械化制備日本血吸蟲童蟲體內，體外培養(yǎng)并分別于電穿孔后第1，3，5天收集童蟲，按TRIzol方法同時提取童蟲的總RNA、DNA及總蛋白。首先以轉染的血吸蟲童蟲DNA為模板，PCR方法擴增表達shRNA質粒中的片段以確定質粒轉染的成功；再經(jīng)實時熒光定量PCR及Western blotting分別檢測Mago nashi基因表達水平變化。另外，按相同方法制備的電穿

7、孔RNAi質粒童蟲分別肌肉注射BALB/c小鼠兩后大腿外側，飼養(yǎng)6周后剖殺小鼠獲取血吸蟲成蟲，制備成蟲整體標本置普通顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡下觀察血吸蟲形態(tài)及生殖器官結構的變化。結果發(fā)現(xiàn)Mago nashi基因的轉錄水平實驗組分別于電穿孔后第1，3，5天較對照組(pSUPER-R組)分別下降了7％，68％，81％(pSUPER-M1組)及27％，41％，66％(pSUPER-M2組)。該基因的蛋白水平在第1，3，5天較對照組(pSUPE

8、R-R組)分別下降了15％，25％，54％(pSUPER-M1組)及18％，28％，42％(pSUPER-M2組)。實驗結果顯示由哺乳動物 H1 啟動子轉錄的shRNA可以特異性抑制日本血吸蟲靶基因和蛋白的表達，短期內(1-5天)效果明顯。雖然經(jīng)小鼠體內獲得用RNAi質粒注射的血吸蟲成蟲形態(tài)大小及主要生殖器官的大小，在普通光學顯微鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)明顯變化。但在共聚焦顯微鏡下可以觀察到其形態(tài)結構的微細變化，發(fā)現(xiàn)實驗組部分雄蟲睪丸內細胞排列緊