日本血吸蟲SjMLP-hsp70的克隆、重組表達及其功能研究.pdf

1、血吸蟲病(schistosomiasis)是由人體血吸蟲(schistosoma)感染引起的一種人獸共患寄生蟲病，主要流行于亞洲、非洲、拉丁美洲的76個國家和地區(qū)。人體血吸蟲主要有曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni,S.m)、埃及血吸蟲(S.haematobium)和日本血吸蟲(Schistosoma japonicum,S.j)等，我國僅有日本血吸蟲病流行。據(jù)2008年全國疫情資料顯示，我國尚有454個流行縣(區(qū))，約

2、41萬慢性感染者，且主要分布在螺情難于控制的江湖洲灘地區(qū)，部分地區(qū)的疫情還有所回升趨勢，或伴隨出現(xiàn)向城市蔓延的趨勢，因此，血吸蟲病仍然是我國重點防治的感染性疾病之一。
　　 防治血吸蟲病的主要措施是采取人畜同步化療及易感地帶滅螺等相結合的綜合性防治方法，但由于現(xiàn)有的以吡喹酮為主要治療藥物的化療再感染率高，且耐藥性不斷嚴重化，使得血吸蟲病的防治進展緩慢，急需在防治理論與關鍵技術方面有所突破。上世紀80年代，隨著分子生物技術的發(fā)展，

3、血吸蟲病疫苗研究重新獲得了人們的重視，疫苗被認為是綜合性防治措施的有效補充，即“藥物化療的短效作用與疫苗接種的長效免疫預防作用相結合不僅能有效減少疾病的總體發(fā)病率，也能避免單純化療后的重復感染”。
　　 抗血吸蟲病疫苗研究歷經(jīng)了死疫苗、減毒活疫苗、基因工程蛋白疫苗及核酸疫苗幾個階段。然而，近20年來的實驗研究已證明，這種單純以刺激Th1或Th2型體液免疫應答為主的特異性抗原分子并不能穩(wěn)定地誘導動物模型高效的保護性免疫力，沒有一個

4、候選分子的保護性實驗能獲得高于40％的保護力。致弱尾蚴疫苗的研究始于上世紀60年代末，大量實驗證明，經(jīng)輻照致弱的侵襲性曼氏血吸蟲或日本血吸蟲尾蚴能誘導實驗動物產(chǎn)生高達90％的保護性免疫力，以至于到現(xiàn)在仍是受公認的最高效、穩(wěn)定的抗血吸蟲病疫苗。對曼氏血吸蟲致弱尾蚴疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，這種保護性免疫力主要是由獲得性免疫機制介導的，由Th1型優(yōu)勢細胞免疫應答向Th2型優(yōu)勢體液免疫應答發(fā)展的持續(xù)性免疫應答過程。
　　 為此，我們實驗室利用雙

5、向凝膠電泳和MALDI-TOF-MS質譜鑒定技術，比較分析紫外致弱尾蚴與正常尾蚴的可溶性蟲體總蛋白，鑒定出20個差異表達蛋白。據(jù)蛋白功能分類可大致分為5類，分別為細胞骨架相關蛋白、能量代謝相關蛋白、信號轉導/調控相關蛋白、熱休克家族相關蛋白及其他功能蛋白如20S蛋白酶體等，結果提示這些差異表達的蛋白質可能與致弱尾蚴誘導高水平免疫力有關，值得進一步研究。在這些差異表達的蛋白分子中，熱休克蛋白家族(heat shock proteinfam

6、ily,HSP)由于其獨特的生物學功能及免疫學特性，受到人們的廣泛重視，特別是HSP70家族。在GenBank/EMBL中，至少存在3種血吸蟲HSP70蛋白序列，其序列長度分別為637aa，648aa和653aa，均含有HSP特異性功能域序列。至目前為止，有關血吸蟲HSP70的研究，主要是針對HSP70-648(一種開放讀框為648aa的HSP70成員)，而有關其他兩種血吸蟲HSP70(HSP70-637和HSP70-653)的研究較少

7、。序列分析發(fā)現(xiàn)，血吸蟲HSP70在曼氏血吸蟲和日本血吸蟲之間高度保守，且與人類的mortalin分子的序列相似性高度70％以上。因此，我們將血吸蟲HSP70-653暫時命名為日本血吸蟲mortalin-like protein(SjMLP/hsp70)。
　　 目的：本研究旨在通過對日本血吸蟲SjMLP/hsp70的克隆、重組表達及其功能研究，為進一步揭示該分子在紫外致弱尾蚴誘導高水平保護性免疫力的效應中可能起的作用提供科學依據(jù)

8、。
　　 方法：主要是從原核和真核水平上，分別評價SjMLP/hsp70的生物學活性、抗原性及免疫保護性，并從真核水平上評價SjMLP/hsp70的佐劑效能。
　　 結果：
　　 ⑴日本血吸蟲mortalin-like protein70(SjMLP/hsp70)的生物信息學分析。序列分析發(fā)現(xiàn)：SjMLP/hsp70具有DnaK功能域，屬于熱休克蛋白家族，其二級結構以α-螺旋為主；通過進化樹分析提示，SjMLP/

9、hsp70是進化上比較保守的蛋白，氨基酸序列上與曼氏血吸蟲熱休克蛋白70序列的相似性最高，與大腸桿菌DnaK的氨基酸序列在進化上也是比較接近的。SjMLP/hsp70含有13個潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點、8個潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點、6個潛在的N-肉豆蔻酰位點、3個潛在的糖基化位點、1個酪氨酸激酶磷酸化位點、1個潛在的亮氨酸拉鏈結構、1個潛在的?；稽c；通過TargetP分析，發(fā)現(xiàn)SjMLP/hsp70定位在線

10、粒體上；通過TMpred預測發(fā)現(xiàn)，SjMLP/hsp70具有信號肽，但沒有明顯的跨膜區(qū)；SjMLP/hsp70含有8個潛在的B細胞表位及多個T細胞表位。
　　 ⑵根據(jù)GenBank中AY813185的序列信息(該序列為Sjmlp/hsp70的代表序列)，設計引物擴增Sjmlp/hsp70的ORF，進而將獲得的目的基因定向插入到pET28a質粒中，經(jīng)PCR、酶切及測序確證該目的基因克隆成功。根據(jù)文獻報道，SjMLP/hsp70可分

11、為核苷酸結合位點(nucleotide binding domain，NBD)及多肽結合位點(peptidebinding domain，PBD)兩個功能域，為此，分別設計引物擴增SjMLP/hsp70的兩個功能域，并克隆到pET28a中，經(jīng)PCR、酶切及測序確證該目的基因克隆成功。RT-PCR結果證實目的蛋白的編碼基因能在成蟲、正常血吸蟲尾蚴、機械力斷尾后尾蚴及蟲卵中均有轉錄。含pET28a-SjMLP/hsp70質粒的宿主菌經(jīng)IPT

12、G誘導2h后，能明顯提高該含重組蛋白的BL21在45℃下的生存率(75％)，提示SjMLP/hsp70具有分子伴侶作用，而SjMLP/hsp70的兩個功能域單獨存在時，均不能改變宿主菌BL21的熱休克后存活率(約40％)，提示這種分子伴侶作用是通過完整蛋白分子完成的。以重組蛋白免疫小鼠，檢測免疫小鼠血清中特異性IgG水平，發(fā)現(xiàn)隨著免疫次數(shù)的增加，特異性IgG滴度快速上升，以IgG2a為主。
　　 ⑶采用切膠免疫的途徑免疫BALB

13、/c小鼠，采用30條尾蚴攻擊感染，45天后解剖小鼠，計算減蟲率和減卵率。結果顯示，與佐劑組相比，rSiMLP/hsp70免疫小鼠的減蟲率和減卵率分別為30.13％和26.60％。根據(jù)GenBank中Sjmlp/hsp70(AY813185)及SjGST26(FN321447.1)的序列信息，設計引物擴增SjLP/hsp70及SjGST26的ORF，進而將獲得的目的基因定向插入到pcDNA3.1質粒中，成功構建了pcDNA3.1-SjML

14、P/hsp70、pcDNA3.1-SjGST26和pcDNA3.1-SjGST26-SjMLP/hsp70質粒。以上述重組真核質粒分別免疫BALB/c小鼠。結果顯示，pcDNA3.1-SjMLP/hsp70和pcDNA3.1-SjGST26混合免疫小鼠的脾細胞IFN-γ分泌水平明顯高于其他免疫小鼠；該組小鼠的減蟲率和減卵率分別40.43％和58.59％，也明顯高于其他免疫小鼠。
　　 結論：①通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)SjMLP/

15、hsp70是定位在線粒體中的具有分子伴侶活性的蛋白；該基因能在正常尾蚴中轉錄；抗熱休克實驗證實SjMLP/hsp70蛋白具有提高E.coli抵抗熱休克從而保護宿主菌的功能，而且證實該功能是通過具有完整結構的蛋白來實現(xiàn)的。②對重組蛋白rSjMLP/hsp70的免疫原性研究發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白具有免疫原性，能誘導免疫動物產(chǎn)生較強的Th1及Th2型免疫應答反應，并能對日本血吸蟲感染具有一定的保護力，提示該分子可能成為血吸蟲病疫苗候選分子，具有進一