日本血吸蟲SjIR-,3-基因的克隆、原核表達(dá)及其抗攻擊感染免疫保護(hù)力的研究.pdf

1、血吸蟲病是一種分布廣、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。現(xiàn)階段我國采取化療為主，結(jié)合易感地帶滅螺和健康教育的策略，研究疫苗作為重要的輔助手段，現(xiàn)已獲得學(xué)界公認(rèn)。血吸蟲SjIR3由感染兔血清篩選日本血吸蟲成蟲cDNA文庫而得到，可能成為疫苗候選分子。為此，本研究在克隆血吸蟲SjIR3基因后，將其亞克隆至pET-32a(+)上，經(jīng)誘導(dǎo)獲得rSjIR3，并進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)以了解其保護(hù)效果。 根據(jù)己發(fā)表的日本血吸蟲SjIR3基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)

2、寡核苷酸引物，從成蟲cDNA文庫PCR擴(kuò)增出SjIR3基因，重組到pMD18-TSimple載體上測(cè)序，通過互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行同源性、跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域和抗原表位分析。按常規(guī)方法收集SjIR3基因，亞克隆至pET-32a(+)載體上，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE及western-blot進(jìn)行分析。動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)采用20±1g昆明系小鼠分A、B、C、D四組，A、B組分別接種rSjIR3和rSjIR

3、3+FCA佐劑，C、D為對(duì)照組分別接種PBS和FCA。按腿部肌肉注射每只小鼠50ug，免疫程序?yàn)?-2-4-6周，尾靜脈采血收集血清，ELISA檢測(cè)IgG水平。8周后，每只小鼠攻擊40±1條尾蚴，45天后剖殺，沖蟲，計(jì)數(shù)減蟲率和減卵率。通過PCR從cDNA文庫擴(kuò)增出900bp的片段，生物信息學(xué)分析表明該DNA與GenBank中的SjIR3(AY251481)100﹪的同源，為一可溶性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)中a螺旋占32.11﹪，β轉(zhuǎn)角占18.7

4、3﹪，無規(guī)卷曲占49.16﹪。該蛋白具有PS50204和SSF69572兩個(gè)Domain，為泛素樣蛋白激酶家族。體外重組表達(dá)的rSjIR3通過SDS-PAGE及western-blot檢測(cè)，rSjIR3分子量約51kD，與預(yù)期分子量相符。動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)表明rSjIR3及rSjIR3+FCA免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生26.63﹪、34.79﹪、26.38﹪、44.09﹪的減蟲率、減卵率。SjIR3基因可以在pET-32a(+)中表達(dá)，重組表達(dá)蛋白