日本血吸蟲童蟲細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠抗攻擊感染的免疫學(xué)研究.pdf

1、第一篇日本血吸蟲童蟲蟲源性細(xì)胞免疫小鼠誘生的保護性效果 【目的】在前期研究中發(fā)現(xiàn)，用日本血吸蟲(Sj)童蟲的蟲源性活細(xì)胞可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較明顯的抗攻擊感染保護性免疫。本研究目的是為了進(jìn)一步確認(rèn)其免疫效果；比較童蟲細(xì)胞和成蟲細(xì)胞，死細(xì)胞與活細(xì)胞誘導(dǎo)宿主所產(chǎn)生的保護性效果差異及其免疫應(yīng)答特點；探索最佳的免疫次數(shù)。 【方法】S.j尾蚴感染小鼠獲得蟲體。胰酶消化法制備蟲源性細(xì)胞。臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活率?；罴?xì)胞經(jīng)-20℃凍融后定為死細(xì)胞

2、。PCR擴增鑒定血吸蟲蟲源性細(xì)胞的種屬特異性并檢測細(xì)胞的純度。本研究設(shè)計了兩個實驗方案。在實驗一中，53只昆明小鼠被分成4組，即對照組10只、18天童蟲活細(xì)胞(LLC)免疫組18只、18天童蟲死細(xì)胞(DLC)免疫組13只和42天成蟲死細(xì)胞(DAC)免疫組11只。每兩周分別用各免疫原對小鼠作皮下注射，共4次。于末次免疫后1周用30±1 S.j尾蚴對小鼠進(jìn)行攻擊感染。感染后第42天剖殺沖蟲，觀察結(jié)果。根據(jù)實驗1結(jié)果，LLC是誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生最佳

3、保護性效果的免疫原，因此，在實驗二中選擇了LLC對昆明小鼠作不同次數(shù)免疫，比較所誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護性免疫，探索最佳免疫次數(shù)。28只小鼠隨機分為4組：免疫1次組(V1)、2次組(V2)和3次組(V3)及對照組(Co)。于末次免疫后第2周用30±1 S.j尾蚴進(jìn)行攻擊感染。感染后第45天解剖小鼠沖蟲。保護性效果的觀察指標(biāo)包括：計數(shù)蟲荷及卵荷；測量蟲體長度和肝組織內(nèi)蟲卵肉芽腫面積；對蟲卵肉芽腫進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。免疫學(xué)觀察指標(biāo)包括：ELISA檢測

4、免疫前后不同時點鼠血清中特異性總抗體(IgG+A+M)和IgG亞類抗體水平的動態(tài)變化；用SDS-PAGE及Western-blot對蟲體與細(xì)胞的成分差異及免疫特性差異進(jìn)行比較分析。 【結(jié)論】本研究表明：來源于18天童蟲的活細(xì)胞可誘導(dǎo)昆明鼠產(chǎn)生較理想的免疫保護效果；免疫2次或3次的保護性效果無顯著差異；IgG亞類絕對水平增高及IgG2a/IgG1比值增高間接反映了Th1型免疫反應(yīng)與保護性免疫呈正相關(guān)；用于免疫接種的細(xì)胞源于蟲體實質(zhì)成

5、分，其中38kDa組分可能是一種優(yōu)勢抗原分子，但對其性質(zhì)與功能有待于進(jìn)一步研究。 第二篇日本血吸蟲童蟲培養(yǎng)細(xì)胞免疫小鼠誘導(dǎo)的保護性效果 【目的】前文研究證明，日本血吸蟲(Sj)童蟲源性細(xì)胞免疫小鼠可獲得較為滿意的抗攻擊感染效果?；诒菊n題組在Sj細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)技術(shù)突破，本研究擬用Sj體外培養(yǎng)細(xì)胞為免疫原，觀察其誘導(dǎo)昆明小鼠所產(chǎn)生的免疫保護性效果以及免疫應(yīng)答類型，以探索研發(fā)此類疫苗的可能性。 【方法】獲取Sj尾蚴感染

6、小鼠后不同發(fā)育期蟲體，在無菌條件下制備蟲源性細(xì)胞，用PRIM-1640-40sj特定培基進(jìn)行體外原代和傳代培養(yǎng)。用臺盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活率。PCR擴增鑒定傳代培養(yǎng)細(xì)胞的種屬特異性并檢測細(xì)胞的純度。通過兩組實驗觀察傳代培養(yǎng)細(xì)胞所誘導(dǎo)的保護性效果及免疫反應(yīng)類型。在實驗一中，3組小鼠每組8只，按1次/兩周間隔經(jīng)腹腔分別注射生理鹽水(NSCo)，18天童蟲培養(yǎng)細(xì)胞(JC-18)及12天童蟲培養(yǎng)細(xì)胞(JC-12)，共進(jìn)行3次免疫。末次接種后第2周用

7、40±2尾/鼠的Sj尾蚴攻擊感染。感染后第42天剖殺沖蟲，觀察保護性效果。在實驗二中，根據(jù)實驗1結(jié)果(發(fā)現(xiàn)JC-12的保護效果優(yōu)于JC-18)，進(jìn)一步比較了體外培養(yǎng)的12天童蟲細(xì)胞(JC-12)和30天成蟲細(xì)胞(AC-30)所誘導(dǎo)的免疫保護性差異。在本實驗中，設(shè)計了兩個接種途徑：腹膜內(nèi)注射(ip)和腹股溝皮下注射(sc)。JCip，JCsc，ACsc和ACip 4個免疫組，每組10只，按1次/兩周的接種間隔共免疫3次。10只對照組小鼠(

8、co)皮下注射D’hanks組。各組小鼠于末次免疫后第4周用30±1尾/鼠Sj尾蚴進(jìn)行攻擊感染，感染后第40天剖殺沖蟲，觀察了所誘導(dǎo)的保護性效果及免疫應(yīng)答類型。用SDS-PAGE和Western-blot對成蟲(AWA)，童蟲(JWA)和童蟲培養(yǎng)細(xì)胞(JCA)的蛋白組分進(jìn)行了分析。用JC-12和AC-30免疫鼠及對照鼠的脾細(xì)胞和血清分別對預(yù)感染Sj尾蚴(50尾±5/鼠)后第5天的小鼠作腹腔注射1次(血清：0.2ml/鼠，脾細(xì)胞：4.5×

9、10<'6>/鼠)，每組6只鼠。被動免疫后第35天剖殺沖蟲，觀察了所誘導(dǎo)的保護性效果及免疫反應(yīng)類型。用免疫鼠脾細(xì)胞與Sj尾蚴于體外共同培養(yǎng)，觀察24h，48h和72h的蟲體死亡率。檢測經(jīng)相應(yīng)抗原刺激后的免疫鼠和非免疫鼠脾細(xì)胞分泌的LI-4和IFN-γ水平。 【結(jié)論】用體外培養(yǎng)的童蟲細(xì)胞免疫昆明小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗血吸蟲攻擊感染的保護性效果，但JC-18所誘生的免疫效果不如JC-12，提示可能越幼期的蟲體細(xì)胞誘生的保護性效果越好。與前

10、文比較，18天童蟲蟲源性細(xì)胞免疫所獲得效果優(yōu)于18天童蟲培養(yǎng)細(xì)胞，其原因可能與實驗批間差異或與細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后某些成分被丟失有關(guān)。實驗1和實驗2的免疫效果有明顯差異，這可能與免疫源制備的穩(wěn)定性或?qū)嶒炁g差異有關(guān)。在有效免疫中，顯示出以Th1型為主的免疫應(yīng)答機制，但結(jié)合體外試驗結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，高水平的保護性效果可能與Th1型和Th2型協(xié)同免疫所發(fā)揮的作用相關(guān)。成蟲培養(yǎng)細(xì)胞不能誘生抗攻擊感染作用的原因以及早期童蟲細(xì)胞免疫接種的最佳方案還有待于進(jìn)一步

11、探索。 第三篇日本血吸蟲細(xì)胞型免疫原模擬表位的篩選及鑒定 【目的】根據(jù)前述研究中證明S.j童蟲細(xì)胞可在小鼠動物模型中誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的抗感染免疫。本研究為了從分子水平了解此類免疫原的保護性機制，采用噬菌體展示技術(shù)對Sj童蟲細(xì)胞抗原模擬肽表位進(jìn)行了免疫篩選與鑒定。 【方法】S,j12天童蟲細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)至4代后，用其活細(xì)胞免疫接種昆明小鼠，收集經(jīng)保護性實驗證明有效的攻擊感染前免疫血清，用飽和硫酸胺沉淀法初純化IgG抗體

12、(抗SjJC-12抗體)后對噬菌體隨機12肽庫進(jìn)行免疫篩選。經(jīng)過4輪免疫淘洗，陽性克隆得到16250倍有效富集。從第4輪篩選結(jié)果中隨機挑選20個克隆，經(jīng)ELISA檢測鑒定出15個陽性克??；通過DNA測序和生物信息學(xué)分析出12個不同序列的陽性克隆。將此12個克隆分別免疫小鼠制備抗血清。用ELISA鑒定12個克隆的免疫原性以及是否為血吸蟲細(xì)胞的免疫模擬表位。用8個含精氨酸殘基的克隆和4個不含精氨酸殘基的克隆分別對昆明鼠進(jìn)行聯(lián)合免疫(1次/1