日本血吸蟲童蟲期抗原分子的篩選及其Th細(xì)胞表位的鑒定.pdf

1、日本血吸蟲病為我國危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病,嚴(yán)重影響人類健康和社會經(jīng)濟發(fā)展,因此控制血吸蟲病的擴散和預(yù)防血吸蟲病的發(fā)生意義重大?？刂迫毡狙x病流行的主要措施是對人、畜進行藥物(吡喹酮)化療,同時結(jié)合傳染源控制、環(huán)境改造、健康教育等綜合防制策略。但實施這一措施費用昂貴,需要大批專業(yè)技術(shù)人員,且存在不能預(yù)防再感染和可能出現(xiàn)耐藥性等問題。因此,亟待開發(fā)血吸蟲疫苗以替代傳統(tǒng)的控制方法。
　　 但怎樣高效合理地篩選和鑒定出抗血吸蟲的保

2、護性抗原一直是個亟待突破的瓶頸。大量研究表明,輻照致弱尾蚴或童蟲免疫在多種動物模型上均獲得較高的保護性效果；另有研究用經(jīng)照射尾蚴轉(zhuǎn)變而來獲得的童蟲在體外培養(yǎng)至肺期,將此時童蟲注射進小鼠真皮內(nèi),也可刺激引起高水平的保護性免疫反應(yīng),表明童蟲期某些特殊蛋白抗原可被看作重要的保護性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)物。此外,一些含有信號肽的分子序列可能分泌到胞外,因而有可能與宿主的免疫系統(tǒng)直接接觸誘導(dǎo)產(chǎn)生抗血吸蟲的免疫應(yīng)答,也可能成為潛在的保護性候選抗原。因此,為

3、高效合理地發(fā)現(xiàn)抗血吸蟲的保護性抗原候選分子,篩選和鑒定在輻照蟲體富集的、童蟲期高表達的以及具有信號肽等特征的分子序列,可能是個值得探索的方向。
　　 在本研究中,我們采用反向疫苗學(xué)策略,從已發(fā)表文獻中得到的日本血吸蟲轉(zhuǎn)錄本組數(shù)據(jù)以及蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)并結(jié)合中國國家人類基因組南方研究中心公布的日本血吸蟲序列篩選出一些目標(biāo)序列,主要篩選出日本血吸蟲肺期童蟲表達的分子,輻照的曼氏血吸蟲章蟲期(4天)富集的分子并通過BLAST方法找到與之同源

4、性最高的日本血吸蟲分子序列；通過在線服務(wù)器找出這些序列中含有信號肽的序列。然后把能夠在肺期童蟲中表達的,與輻照曼氏血吸蟲童蟲(4天)富集分子同源的,以及含有信號肽等特征的日本血吸蟲分子序列進行分析比較,結(jié)果得到具有如下三方面特征的候選分子:(1)既是肺期童蟲高表達又含有信號肽的分子序列21條；(2)既與輻照后曼氏血吸蟲4天蟲體富集的序列同源又含有信號肽的分子序列2條；(3)既與輻照后曼氏血吸蟲4天蟲體富集序列同源又是肺期章蟲高表達的序列

5、3條。為后續(xù)保護性Th細(xì)胞表位的預(yù)測分析提供了基礎(chǔ)。
　　 為篩選候選上述候選分子中可能的保護性Th細(xì)胞表位,應(yīng)用免疫信息學(xué)技術(shù)對上述26條候選序列進行了Th細(xì)胞表位的預(yù)測。使用分別基于矩陣和結(jié)構(gòu)算法的HLAPRED和MHCPred服務(wù)器預(yù)測同HLAⅡ類等位基因分子結(jié)合的Th細(xì)胞表位；使用基于基序分析原理發(fā)展的位置矩陣法的SYFPEITHI服務(wù)器預(yù)測同HLAⅡ類等位基因分子結(jié)合的15肽Th細(xì)胞表位；使用MHCPred服務(wù)器預(yù)測同

6、鼠源H2d型MHCⅡ分子的結(jié)合表位；應(yīng)用基于分子動力學(xué)算法的受體配體嵌合空間結(jié)合模擬服務(wù)器,模擬肽與MHCⅡ類分子的錨定情況,最后得到候選的Th細(xì)胞表位:NH—NNSVVIEKSHFLNVL—COOH[AAW26577];NH—MFGYDKVLPMNSGVE—COOH[AAW26182];NH—ISVFLFVLTFQYIIS—COOH[AAW24929];NH—SFFFFLIIHNKIGLA—COOH[AAW25469];NH—GRVW

7、QVIILTGSYWM—COOH[EZ000175];NH—MEAFKTFDREGQGFI—COOH[AAW26398]為后續(xù)實驗鑒定奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 為實驗證實上述序列分析和表位預(yù)測結(jié)果,用人工合成多肽法(四分臂偶聯(lián)法合成到多聚賴氨酸骨架上)合成上述表位肽進行下述實驗鑒定:RT—PCR法檢測各候選表位肽的源分子序列在日本血吸蟲肺期童蟲(3天)的表達情況；用流式細(xì)胞術(shù)檢測出其中四條肽與小鼠抗原遞呈細(xì)胞(APCs)的直接結(jié)合

8、情況；用改良的MTT法(CCK-8試劑)測定候選表位肽體外刺激免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫小鼠淋巴細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的分泌情況。
　　 實時定量PCR測定結(jié)果,這些肽的源序列分子都可以在3天正常童蟲期表達。用其中的四條預(yù)測肽(P1、P2、P5和P6)體外直接結(jié)合鼠脾細(xì)胞實驗結(jié)果表明,43％-88％的細(xì)胞被生物素化的肽標(biāo)記上,用競爭性未標(biāo)記肽檢測顯示對標(biāo)記肽的結(jié)合抑制率在56％-93.66％之間,用抗I-A

9、d和抗I—Ed的抗體競爭孵育檢測,結(jié)果抑制率分別為68％-87％和49％-75％,分別相似于和高于陽性對照組的抑制率,都可以很好地與小鼠抗原遞呈細(xì)胞直接結(jié)合。淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果表明,除P3肽外,其余5個肽的刺激指數(shù)顯著高于佐劑對照組的,P2、P4和P6肽組的刺激指數(shù)則顯著高于多聚賴氨酸骨架組的,說明它們可以不同程度的刺激免疫鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。免疫鼠CD4+T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的分泌圖式測定顯示,P1、P2和P5肽體外刺激免疫鼠脾淋巴細(xì)胞后,

10、分泌Th1細(xì)胞因子IFN—γ的CD4+T細(xì)胞的比例要高于分泌Th2細(xì)胞因子IL-4的CD4+T細(xì)胞的比例,而P4肽誘導(dǎo)的免疫鼠CD4+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的圖式與上述肽的相反,P3和P6肽則沒能誘導(dǎo)免疫鼠產(chǎn)生肽特異的CD4+T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌,初步說明P1、P2和P5肽可能是潛在的Th1細(xì)胞表位,P4肽可能是潛在的Th2細(xì)胞表位。
　　 總之,我們通過日本血吸蟲轉(zhuǎn)錄本組學(xué)數(shù)據(jù)的分析和免疫信息學(xué)預(yù)測,篩選得到了26個日本血吸蟲