日本血吸蟲復(fù)合B細(xì)胞表位抗原的研究.pdf

1、血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類健康的人畜共患寄生蟲病。我國是全球血吸蟲病危害最嚴(yán)重的國家(埃及、蘇丹、中國、巴西)之一，我國流行日本血吸蟲病，主要流行于長江流域及以南的12個(gè)省(市、自治區(qū))的434個(gè)縣（市、區(qū)），受威脅的人口約2億。經(jīng)50多年防治血吸蟲病的不懈努力，我國血吸蟲病防治工作已取得了巨大的成績。但目前全國仍有109個(gè)縣（市、區(qū)）有血吸蟲病流行，病人數(shù)達(dá)84.25萬，病畜約2.41萬頭。 血吸蟲病的診斷在血吸蟲病防治中起著

2、極為重要的作用。隨著血吸蟲病防治措施的實(shí)施，流行區(qū)的感染度和感染率明顯下降，以至血吸蟲病經(jīng)典的寄生蟲學(xué)診斷方法－糞檢的敏感性明顯下降，并且由于糞便檢查費(fèi)工、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，疫區(qū)群眾的依從性逐年下降，這種經(jīng)典的寄生蟲學(xué)診斷技術(shù)在現(xiàn)場大規(guī)模查病中的應(yīng)用受到很大的限制。由于免疫診斷技術(shù)具有操作簡便、敏感性較高、特異性較好等優(yōu)點(diǎn)，因此發(fā)展免疫學(xué)診斷方法來代替或補(bǔ)充糞檢為廣大專業(yè)人員所采納。常用的免疫學(xué)診斷方法所采用的檢測抗原多為血吸蟲成蟲或蟲卵抗原

3、，這些抗原成分復(fù)雜且成本較高；而用基因工程方法制備完整的抗原雖可以獲得較純的抗原，但常常由于表達(dá)效率不高或純化困難，因而限制了其的廣泛應(yīng)用。因此，人們迫切希望獲得針對性強(qiáng)、診斷效率又高，并容易制備的抗原，以代替復(fù)雜的粗抗原或全長的分子抗原，使診斷更具有針對性，在保證抗原敏感性較高的前提下更進(jìn)一步提高其特異性。 表位，又稱抗原決定簇，是指免疫應(yīng)答中被特異的效應(yīng)分子或T、B淋巴細(xì)胞識別的抗原分子上的特定結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。B細(xì)胞表位是指抗原中

4、可被B細(xì)胞抗原受體（BCR）或抗體特異性識別并相互結(jié)合的線性片斷或空間構(gòu)象型結(jié)構(gòu)。B細(xì)胞表位的預(yù)測對于免疫原性多肽的設(shè)計(jì)、新型疫苗分子的設(shè)計(jì)都有很大的幫助，并且有利于診斷試劑的開發(fā)以及臨床疾病的預(yù)防與診斷。近年來，隨著免疫學(xué)理論、蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展和生物信息學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們對B細(xì)胞表位預(yù)測的研究方法和思維方法有了新的進(jìn)展。隨著對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的研究認(rèn)識，B細(xì)胞表位預(yù)測得到了進(jìn)一步的發(fā)展。但以一種抗原分

5、子或者單一的表位抗原用于血吸蟲病診斷的敏感性和特異性是有限的，所以我們設(shè)想采用多個(gè)抗原分子或者多個(gè)抗原的B細(xì)胞表位的復(fù)合，發(fā)展復(fù)合表位抗原，用于血吸蟲病的免疫診斷。 本研究擬通過生物信息學(xué)軟件BioSun分析在具有診斷潛能的四個(gè)日本血吸蟲候選分子即日本血吸蟲22.6 kDa膜蛋白（Sj22.6）、23 kDa膜蛋白（Sj23）、信號蛋白14-3-3(Sj14-3-3)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（Sj26）中預(yù)測出相關(guān)的B細(xì)胞表位，采用分

6、子生物學(xué)方法通過原核表達(dá)及純化，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot鑒定，獲得可被血吸蟲病人血清識別的表位抗原片斷。通過隨機(jī)順序法連接相關(guān)候選表位，構(gòu)建復(fù)合B細(xì)胞表位表達(dá)得到融合蛋白，再次通過Western blot證實(shí)其抗原性。進(jìn)一步通過現(xiàn)場應(yīng)用以評估該復(fù)合B細(xì)胞表位抗原用于血吸蟲病免疫診斷的應(yīng)用價(jià)值。 第一部分：日本血吸蟲診斷分子B細(xì)胞表位的預(yù)測、構(gòu)建、 表達(dá)和純化 根據(jù)日本血吸蟲中具有診斷潛能的四個(gè)候選分子即

7、日本血吸蟲膜蛋白22.6 kDa（Sj22.6）、23 kDa膜蛋白（Sj23）、信號蛋白14-3-3(Sj14-3-3)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（Sj26）的氨基酸序列，用生物信息學(xué)軟件BioSun分析和預(yù)測其B細(xì)胞表位，確定了8個(gè)候選表位（每個(gè)分子中選擇2個(gè)表位片斷）。設(shè)計(jì)并合成目的表位的編碼核苷酸，克隆入高效融合表達(dá)載體pET-32c(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒，用酶切法及測序法鑒定。酶切和測序結(jié)果顯示重組成功。

8、陽性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用Ni2＋-NTT柱純化并在PBS中透析，獲得了大量的可溶性候選表位融合蛋白，12％聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示為單一條帶。經(jīng)Western blot檢測，P1～P8這8個(gè)目的蛋白中僅有P2（來自Sj22.6）、P6（來自Sj14-3-3）、P7（來自Sj26）可與血吸蟲病人陽性血清反應(yīng)而與健康人血清無反應(yīng)，其余5個(gè)目的蛋白與血吸蟲病人血清和健康人血清均無反應(yīng)。表明這3條目的蛋白片斷可

9、能為具有潛在診斷價(jià)值的B細(xì)胞表位。 第二部分 日本血吸蟲復(fù)合B細(xì)胞表位診斷分子的 構(gòu)建與鑒定 鑒于一種抗原分子或者單一的抗原表位用于血吸蟲病診斷的敏感性和特異性常常非常有限，我們設(shè)想采用多種抗原的B細(xì)胞表位的復(fù)合，構(gòu)建復(fù)合B細(xì)胞表位診斷分子，以達(dá)到提高診斷血吸蟲病效能作用。 根據(jù)上一個(gè)實(shí)驗(yàn)得到的三條B細(xì)胞表位片斷P2（來自Sj22.6）、P6（來自Sj14-3-3）、P7（來自Sj26），用隨機(jī)順序法連

10、接這三個(gè)候選B細(xì)胞表位片斷，得到P2-P6-P7和P6-P2-P7這2個(gè)片斷，并分別重組入高效融合表達(dá)載體pET-32c(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切法和DNA測序鑒定獲得重組質(zhì)粒。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，這2個(gè)質(zhì)粒均可表達(dá)分子量約20.4KDa的融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物用Ni2＋-NTT柱純化并在PBS中透析，12％聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示單一條帶。抗原性鑒定結(jié)果顯示這2個(gè)重組復(fù)合表位蛋白均可被日本血吸蟲病人血

11、清識別，而不與健康人血清反應(yīng)，表明其具有診斷血吸蟲病的潛能，為應(yīng)用復(fù)合表位抗原診斷血吸蟲病的研究奠定了基礎(chǔ)。 第三部分 重組復(fù)合B細(xì)胞表位抗原用于血吸蟲病 診斷的初步研究 用純化的重組日本血吸蟲診斷分子復(fù)合B細(xì)胞表位抗原作為檢測抗原，建立間接ELISA方法，檢測日本血吸蟲感染者血清和非血吸蟲病流行區(qū)健康者血清，以及肝吸蟲和肺吸蟲病人血清，并與可溶性蟲卵抗原（SEA）進(jìn)行比較，以評價(jià)該抗原用于血吸蟲病免疫診斷的

12、應(yīng)用價(jià)值。 通過正交試驗(yàn)，獲得了采用重組復(fù)合表位抗原CZ-1進(jìn)行間接ELISA的最佳檢測條件：重組抗原的包被濃度為10μg/ml，血清稀釋度為1：200，酶標(biāo)記的羊抗人IgG為1：1000。檢測50份慢性血吸蟲病感染者血清，均為陽性反應(yīng)，敏感性達(dá)到100％；40份來自非血吸蟲病流行區(qū)健康人血清，未見陽性反應(yīng)。與相同條件下以SEA為抗原的檢測結(jié)果相比較，結(jié)果相同。但檢測15份肝吸蟲病人血清，應(yīng)用CZ-1抗原有1份（7％）陽性，SE