日本血吸蟲(chóng)雌性特異基因的篩選及排泄-分泌抗原的篩選.pdf

1、研究背景：血吸蟲(chóng)病是由血吸蟲(chóng)感染引起的一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病。據(jù)世界衛(wèi)生組織專(zhuān)家估計(jì)，目前仍有76個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行血吸蟲(chóng)病，有2億人受感染，6億人受威脅。人體血吸蟲(chóng)病的病原為日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma，aponicum)，埃及血吸蟲(chóng)(S. haematobium Bilharz)，曼氏血吸蟲(chóng)(S. mansoni Sambon)．間插血吸蟲(chóng)(S.intercalatum Fisher)，湄公血吸蟲(chóng)(S.meko

2、ngi Voge et al )和馬來(lái)血吸蟲(chóng)(S. malayensis Greer et al)。在我國(guó)流行的血吸蟲(chóng)病為日本血吸蟲(chóng)(中國(guó)大陸株)。日本血吸蟲(chóng)病曾流行于我國(guó)南方12個(gè)省(市)、自治區(qū)，至今仍有8個(gè)省127個(gè)縣，至少有2300萬(wàn)人受血吸蟲(chóng)病的威脅。盡管血吸蟲(chóng)病的防治主要依靠化療及殺滅釘螺，但是血吸蟲(chóng)病的控制并不理想。因而血吸蟲(chóng)病的研究轉(zhuǎn)向了對(duì)血吸蟲(chóng)基礎(chǔ)原理的研究，尤其是對(duì)其基因組的研究。血吸蟲(chóng)基因組計(jì)劃(Schistoso

3、ma Genome Project，SGP)始創(chuàng)于1992年，“血吸蟲(chóng)基因發(fā)現(xiàn)計(jì)劃”是SGP的一部分，該計(jì)劃目的是通過(guò)對(duì)血吸蟲(chóng)(曼氏血吸蟲(chóng)和日本血吸蟲(chóng))新基因的研究，搜集血吸蟲(chóng)生理活動(dòng)、耐藥機(jī)制和免疫逃避方面的資料，為找到新的治療藥物和疫苗奠定基礎(chǔ)。盡管血吸蟲(chóng)病的防治主要依靠藥物治療及殺滅釘螺，但是血吸蟲(chóng)病的控制卻并不樂(lè)觀，其中的原因有：治療藥物的毒性、行政管理的不善、寄生蟲(chóng)抗藥性等治療上的限制，頻繁的重復(fù)感染，有效疫苗的使用和研制進(jìn)程

4、受到限制及對(duì)血吸蟲(chóng)生物學(xué)知識(shí)的了解不夠深入等等。因而在這個(gè)血吸蟲(chóng)病防治研究的瓶頸期，大規(guī)模地從基因水平了解血吸蟲(chóng)基本的生物學(xué)、抗藥性機(jī)制、決定免疫逃避機(jī)制的抗原變異等等都是非常重要的。關(guān)于血吸蟲(chóng)雌性特異性基因方面的研究過(guò)去報(bào)道很少，這些基因都是用傳統(tǒng)方法逐個(gè)鑒定的，不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且單個(gè)基因的克隆表達(dá)，無(wú)法得到基因之間變化的相關(guān)性，因此利用高效的分離、分析技術(shù)研究雌蟲(chóng)特異基因的表達(dá)，就有重要的意義(如性成熟相關(guān)基因、產(chǎn)卵相關(guān)基因、雌雄合

5、抱信息傳遞相關(guān)基因等等)，對(duì)篩選相關(guān)重要功能、闡明其結(jié)構(gòu)與功能，不僅對(duì)解讀血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理有重要意義，更可為合理的設(shè)計(jì)抗病疫苗或新藥物等提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，有助于開(kāi)拓防治血吸蟲(chóng)病的新途徑。本研究擬將抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization SSH)和表達(dá)序列標(biāo)簽(ExpressionSequence Tag，EST)這一有效的技術(shù)方法應(yīng)用于血吸蟲(chóng)雌性特異基因的篩選。SSH是一種篩選差異

6、表達(dá)基因的技術(shù)，它是以抑制性PCR(suppression PCR)為基礎(chǔ)，將消減雜交(subtractive hybfidization，SH)和cDNA單鏈檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化(normalization)合為一體，具有假陽(yáng)性低、敏感性高、速度快、效率高等特點(diǎn)。而EST是一些從基因文庫(kù)中隨機(jī)挑取的cDNA短序列(約300bp)，利用已有的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索進(jìn)行DNA或蛋白質(zhì)的同源性分析，可以鑒定這些基因的起源，從而達(dá)到發(fā)現(xiàn)基因的目的。我們?cè)诮⑷毡狙?/p>

7、吸蟲(chóng)雌成蟲(chóng)扣除雄成蟲(chóng)消減cDNA文庫(kù)的基礎(chǔ)上利用SSH技術(shù)篩選出雌性特異表達(dá)基因，利用EST從日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中篩選雌成蟲(chóng)特異的cDNA序列，并對(duì)其功能進(jìn)行研究。從而找到一些有價(jià)值的性別特異性基因，為血吸蟲(chóng)病疫苗的研制及防治方法的選擇提供依據(jù)，將對(duì)血吸蟲(chóng)病的防治具有重要的意義。 血吸蟲(chóng)的排泄一分泌(exretory-secretory，E-S)抗原是血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)進(jìn)入人體后在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的排泄分泌產(chǎn)物，包括童蟲(chóng)、成蟲(chóng)及雌

8、蟲(chóng)產(chǎn)出的蟲(chóng)卵在發(fā)育成熟過(guò)程中的排泄分泌物。這些抗原直接與宿主免疫系統(tǒng)接觸，與宿主的抗體形成、免疫調(diào)節(jié)及肉芽腫的形成密切相關(guān)，因而對(duì)血吸蟲(chóng)排泄一分泌抗原進(jìn)行蛋白質(zhì)譜的鑒定研究，不僅可以掌握更多的疫苗及診斷候選分子，還能更全面地了解血吸蟲(chóng)一宿主的免疫關(guān)系，包括所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)、宿主肉芽腫形成的機(jī)制等等。本研究通過(guò)對(duì)日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)、成蟲(chóng)體外產(chǎn)出的蟲(chóng)卵進(jìn)行體外培養(yǎng)，收集其E-S抗原。雙向凝膠電泳后，切取目標(biāo)蛋白，LC-MS/MS進(jìn)行多肽測(cè)序。測(cè)

9、得的多肽序列利用NCBI的Blast網(wǎng)站的Blast P及BlastN進(jìn)行同源性搜索，并對(duì)血吸蟲(chóng)不同階段的E-S抗原譜進(jìn)行分析。這是首次對(duì)血吸蟲(chóng)的E-S抗原進(jìn)行系統(tǒng)的蛋白質(zhì)譜鑒定分析的研究。我們還發(fā)現(xiàn)通過(guò)體外培養(yǎng)收集E-S抗原具有簡(jiǎn)單易行、純度高、不易污染、不受宿主成分的影響等優(yōu)點(diǎn)。目的： 1．發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)雌成蟲(chóng)特異性基因，通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的軟件與所有已知基因和蛋白做同源性分析，初步了解這些基因的功能；找到一些與雌蟲(chóng)的

10、生殖發(fā)育和產(chǎn)卵有關(guān)的基因，并對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證。 2．本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)對(duì)日本血吸蟲(chóng)的E-S抗原盡可能多地進(jìn)行鑒定和分析，獲得盡可能完善的E-S抗原蛋白質(zhì)譜。為發(fā)現(xiàn)新的疫苗候選分子提供充分的數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。 方法： 1．應(yīng)用Clontech PCR-Select<'TM> cDNA Subtraction Kit構(gòu)建日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)的消減性cDNA庫(kù)。此庫(kù)中的cDNA與T載體連接環(huán)化成質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化細(xì)菌，篩選

11、有插入片段的克隆。 2．隨機(jī)挑選一些陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chainreaction PCR)擴(kuò)出插入片段，瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，然后分別與<'32>p標(biāo)記的雌雄成蟲(chóng)第一鏈cDNA探針雜交，篩選出含雌蟲(chóng)特異性的基因片段的質(zhì)粒DNA。 3．將得到的雌性特異性基因用Blast X及Blast N(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/blast/)程序進(jìn)行同

12、源性搜索，對(duì)基因的功能進(jìn)行深入的生物信息學(xué)分析。 4．通過(guò)對(duì)日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)、蟲(chóng)卵體外培養(yǎng)方法的建立來(lái)收集E-S抗原。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建了日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)的消減cDNA文庫(kù)。 2．得到正向消減及反向消減cDNA文庫(kù)，斑點(diǎn)雜交篩選出50個(gè)雌蟲(chóng)特異性表達(dá)的克隆。 3．將隨機(jī)挑選出的50個(gè)與正向消減文庫(kù)探針雜交信號(hào)值明顯高于與反向消減文庫(kù)探針雜交信號(hào)值的克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序得到了42個(gè)EST，其中17個(gè)基

13、因與已知日本血吸蟲(chóng)卵殼蛋白基因高度同源；17個(gè)基因與日本血吸蟲(chóng)未知基因高度同源、且有一小段與卵殼蛋白基因高度同源；有8個(gè)基因與日本血吸蟲(chóng)其他未知基因高度同源。 4．成功的進(jìn)行了日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)和蟲(chóng)卵的體外培養(yǎng)，并獲得了E-S抗原。 結(jié)論： 1．構(gòu)建了雌、雄蟲(chóng)正向及反向消減cDNA文庫(kù)。用抑制性消減雜交技術(shù)(Suppression subtractive hybridization，SSH)篩選了日本血吸蟲(chóng)雌性特異性