日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因SjTNFR的初步研究.pdf

1、血吸蟲病是一種全球分布、影響較為嚴(yán)重的重要人獸共患病。目前可用治療藥物存在潛在抗性，同時(shí)缺乏有效的疫苗，使得新藥的開發(fā)顯得尤為重要。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種主要方式。日本血吸蟲細(xì)胞凋亡的深入研究可為篩選日本血吸蟲新藥靶提供新思路。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因SjTNFR的克隆、原核和真核表達(dá)、及該基因生物學(xué)功能的初步探討，為深入闡述日本血吸蟲的凋亡機(jī)制積累了知識(shí)，為評(píng)估SjTNFR作為血吸蟲病治療藥物靶標(biāo)的潛力提供了基礎(chǔ)。<

2、br>　　1.日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因SjTNFR的克隆表達(dá)及生物學(xué)特性分析
　　利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了日本血吸蟲SjTNFR的全長序列，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。序列分析表明該基因ORF含603bp，編碼200個(gè)氨基酸，理論分子量為22.3Da，理論等電點(diǎn)為7.6。生物信息學(xué)分析表明該基因不含有信號(hào)肽以及跨膜區(qū)序列。結(jié)構(gòu)域分析表明該基因編碼蛋白屬于TNFR超家族成員。構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjTNFR，并在大腸桿菌中成功表達(dá)。

3、Real-time PCR結(jié)果顯示該基因在大、小鼠來源14d、23d、32d、和42d四個(gè)不同發(fā)育階段蟲體均有表達(dá)，其中大鼠來源蟲體SjTNFR的表達(dá)水平在14d后都明顯高于小鼠來源蟲體，在感染后32d和42d表達(dá)差異更明顯（P<0.05）。提示該基因的差異表達(dá)可能是影響血吸蟲在大、小鼠不同適宜性宿主體內(nèi)生長發(fā)育的因素之一。
　　2. SjTNFR的真核表達(dá)及功能初步分析
　　通過PCR技術(shù)擴(kuò)增到SjTNFR功能區(qū)片段，成功

4、構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pxj-40-SjTNFR，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。細(xì)胞間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染pxj-40-SjTNFR質(zhì)粒的293T細(xì)胞表達(dá)SjTNFR蛋白。Western blotting分析結(jié)果進(jìn)一步證明了重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中成功表達(dá)，SjTNFR重組蛋白分子量大小約為26 kDa。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞早期凋亡比例為25.3％，而對(duì)照組為2.73%，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞晚期凋亡比