日本血吸蟲排泄分泌蛋白的研究.pdf

1、日本血吸蟲病是由日本血吸蟲感染引起的一種慢性、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。血吸蟲釋放或分泌一些抗原分子進(jìn)入宿主體內(nèi)，這些分子直接暴露于宿主免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答。一些排泄分泌蛋白（excretory/secretory proteins，ESPs），包括早期童蟲和其它不同發(fā)育階段蟲體差異表達(dá)的排泄分泌蛋白對血吸蟲在終末宿主體內(nèi)感染的建立和維持至關(guān)重要。研究日本血吸蟲童蟲和成蟲不同發(fā)育階段排泄分泌蛋白質(zhì)的組成和變化，鑒定分析與

2、日本血吸蟲生長、發(fā)育、繁殖等相關(guān)的重要分子，將有助于理解血吸蟲與宿主間的相互作用機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)血吸蟲免疫調(diào)節(jié)關(guān)鍵分子及血吸蟲病的疫苗候選分子。
　　1．日本血吸蟲14d童蟲排泄分泌蛋白質(zhì)組分析
　　日本血吸蟲具有復(fù)雜的生活史，童蟲是血吸蟲在終末宿主體內(nèi)的早期發(fā)育階段，是疫苗介導(dǎo)保護(hù)性免疫的主要靶標(biāo)。排泄分泌蛋白在宿主與寄生蟲相互作用中扮演重要角色，而日本血吸蟲童蟲排泄分泌蛋白質(zhì)組至今尚未有研究報道。本實(shí)驗首次應(yīng)用高效液相色

3、譜法和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對日本血吸蟲14d童蟲排泄分泌蛋白質(zhì)的組成進(jìn)行分析鑒定，最終鑒定到713種蛋白。這些蛋白的理論分子量介于10kDa和70kDa之間，理論等電點(diǎn)介于3到13之間。生物信息學(xué)分析顯示，鑒定到的童蟲排泄分泌蛋白主要參與應(yīng)激反應(yīng)（如heat shock protein）、碳水化合物代謝（如glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、蛋白質(zhì)降解（如protein disulfide iso

4、merase）等，其中一些 ESPs可能是與日本血吸蟲早期童蟲適應(yīng)寄生生活，維持在終末宿主體內(nèi)生存、發(fā)育等相關(guān)的重要分子。本研究有助于了解日本血吸蟲童蟲與宿主間的相互作用機(jī)制及血吸蟲病疫苗候選分子的篩選。
　　2．日本血吸蟲童蟲和成蟲排泄分泌蛋白質(zhì)組的比較分析
　　童蟲和成蟲是日本血吸蟲寄生于終末宿主體內(nèi)的兩個主要發(fā)育階段蟲體，它們具有不同的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征。童蟲和成蟲期別差異表達(dá)的排泄分泌蛋白在血吸蟲的感染建立和維持、發(fā)

5、育和繁殖過程中發(fā)揮了不同的生物學(xué)功能。本實(shí)驗首次應(yīng)用 iTRAQ和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，完成了日本血吸蟲14d童蟲和42d成蟲排泄分泌蛋白質(zhì)組的比較分析，最終鑒定到298種差異蛋白。其中，童蟲高表達(dá)蛋白有161個，包括hot shock proteins、glucose-6-phosphate isomerase、protein disulfide isomerase等，生物信息學(xué)分析顯示這些蛋白主要參與應(yīng)激反應(yīng)、碳水化合物代謝和蛋白降解等過程

6、；成蟲高表達(dá)蛋白有137個，包括thioredoxin peroxidase、adenine phosphoribosyltransferase等，它們主要與免疫調(diào)節(jié)和嘌呤代謝等相關(guān)；另有31個蛋白在童蟲和成蟲間不具有顯著性差異，如phosphoglycerate mutase等。該研究可為闡述童蟲和成蟲生理學(xué)上的差異，及理解這兩個發(fā)育階段蟲體差異表達(dá) ESPs在血吸蟲生長發(fā)育中的作用提供實(shí)驗依據(jù)，同時也可為尋找有效的疫苗候選分子提供基

7、礎(chǔ)。
　　3．日本血吸蟲蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶SjPDI的克隆、表達(dá)及重組蛋白rSjPDI誘導(dǎo)抗血吸蟲感染免疫保護(hù)效果的評價
　　蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）為本研究排泄分泌蛋白組分析中鑒定到的一種日本血吸蟲排泄分泌蛋白。本文應(yīng)用PCR技術(shù)對 SjPDI基因進(jìn)行克隆，該基因具有1410bp的開放閱讀框，編碼469個氨基酸。構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-SjPDI，并在B

8、L21大腸桿菌中獲得成功表達(dá)，得到相對分子質(zhì)量約為55 kDa的可溶性重組蛋白rSjPDI。Western blotting 分析顯示，rSjPDI可以被日本血吸蟲成蟲蛋白免疫兔血清識別，日本血吸蟲成蟲蛋白和成蟲排泄分泌蛋白可以被rSjPDI免疫小鼠血清識別，說明重組蛋白rSjPDI具有良好的免疫原性和抗原性，且SjPDI確實(shí)存在于日本血吸蟲排泄分泌蛋白中。實(shí)時定量PCR分析表明SjPDI在各個檢測的生長發(fā)育階段蟲體中均有表達(dá)

9、，且在42天成蟲和早期童蟲體內(nèi)呈高表達(dá)。免疫熒光試驗結(jié)果顯示， SjPDI主要定位于日本血吸蟲表膜及實(shí)質(zhì)組織內(nèi)。生物學(xué)特性分析顯示，重組蛋白rSjPDI具有蛋白異構(gòu)和抗氧化等功能。ELISA實(shí)驗表明rSjPDI可引起免疫小鼠產(chǎn)生高水平的特異性IgG抗體。在兩批小鼠免疫保護(hù)實(shí)驗中，與對照組相比，rSjPDI免疫組分別獲得35.32％和26.19%的減蟲率及33.17%和31.7%的肝臟蟲卵減少率。本研究表明排泄分泌蛋白SjPDI在血吸蟲生

10、長發(fā)育過程中扮演著重要角色，為一種潛在的日本血吸蟲病疫苗候選分子。
　　4．日本血吸蟲谷胱甘肽脫氫酶對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制研究
　　巨噬細(xì)胞在機(jī)體抗寄生蟲感染中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，在促炎性和抗炎性反應(yīng)中扮演重要角色。谷胱甘肽脫氫酶為本研究排泄分泌蛋白組分析中鑒定到的另一種重要的日本血吸蟲排泄分泌蛋白。該蛋白含有GSTs結(jié)構(gòu)域，與克氏錐蟲Tc52免疫調(diào)節(jié)分子具有相同的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。本實(shí)驗首次對日本血吸蟲谷

11、胱甘肽脫氫酶進(jìn)行克隆表達(dá)，分析該重組蛋白對RAW264.7巨噬細(xì)胞活化的影響及其潛在的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明，重組日本血吸蟲谷胱甘肽脫氫酶可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和iNOS的表達(dá)，同時可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中microRNA-146a分子的表達(dá)水平。進(jìn)一步分析顯示，miR-146a對LPS活化的巨噬細(xì)胞IL-1β的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用，miR-146a可能參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞促炎性免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究表明重組日本血

12、吸蟲谷胱甘肽脫氫酶可以通過影響巨噬細(xì)胞活化和促炎性反應(yīng)參與宿主免疫應(yīng)答進(jìn)程，該分子可能在血吸蟲的生存和發(fā)育中具有重要作用。
　　綜上，本研究應(yīng)用高效液相色譜法和串聯(lián)質(zhì)譜法對日本血吸蟲14d童蟲排泄分泌蛋白組的組成進(jìn)行分析鑒定，應(yīng)用iTRAQ和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對日本血吸蟲14d童蟲和42d成蟲排泄分泌蛋白組進(jìn)行比較分析。對日本血吸蟲排泄分泌蛋白SjPDI的編碼基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)及生物學(xué)特性研究，對重組蛋白rSjPDI誘導(dǎo)小鼠抗日本血吸