華支睪吸蟲(chóng)模擬抗原表位的篩選和鑒定.pdf

1、目的:應(yīng)用噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)技術(shù)篩選可以與華支睪吸蟲(chóng)病人混合血清特異性結(jié)合的華支睪吸蟲(chóng)模擬抗原表位，分析其序列、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及免疫活性，探討應(yīng)用華支睪吸蟲(chóng)模擬抗原表位檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)病人血清的可行性。 方法:(1)用飽和硫酸銨鹽析法提取華支睪吸蟲(chóng)病人混合血清IgG，Lawry 法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE鑒定IgG的純度，斑點(diǎn)免疫金銀染色(dot-IGSS)檢測(cè)純化IgG的活性。(2)用純化IgG對(duì)噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行3

2、輪親和篩選。(3)ELISA法檢測(cè)第三輪篩選后隨機(jī)挑選的噬菌體單克隆的免疫活性并予以擴(kuò)增。(4)依ELISA的檢測(cè)結(jié)果挑選免疫活性較高的克隆進(jìn)行序列分析及免疫學(xué)鑒定。(5)Western blot檢測(cè)各陽(yáng)性噬菌體單克隆展示的表位類(lèi)型。 結(jié)果:(1)經(jīng)過(guò)純化后收集到免疫球蛋白，Lowry法測(cè)定其濃度為5.3mg/ml，SDS-PAGE電泳未見(jiàn)雜帶，達(dá)到電泳純，純化IgG與華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原斑點(diǎn)免疫金銀染色反應(yīng)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性。(2)經(jīng)

3、3輪篩選，噬菌體的回收率逐輪上升，說(shuō)明篩選中所獲得的噬菌體克隆有較高程度的富集。(3)隨機(jī)挑選的20個(gè)單個(gè)噬菌斑的擴(kuò)增液，ELISA檢測(cè)其中12個(gè)為陽(yáng)性，從中挑取6個(gè)免疫活性較高的克隆(P1～P6)進(jìn)行的DNA序列分析，得到6個(gè)DNA序列。(4)斑點(diǎn)免疫金銀染色檢測(cè)6個(gè)克隆有3個(gè)可被華支睪吸蟲(chóng)病人血清識(shí)別(P1～P3)。(5)用ELISA法對(duì)華支睪吸蟲(chóng)模擬抗原表位和華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原(CsA)進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，顯示這6個(gè)模擬抗原表位特異性及