擬態(tài)弧菌OmpU抗原模擬表位的篩選鑒定及其免疫特性分析.pdf

1、水產(chǎn)動物腹水病是由擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus，Vm)引起的危害嚴重的細菌性疾病[1-6]。目前控制該病的主要手段是抗菌治療，但是隨著抗生素的長期使用，細菌產(chǎn)生耐藥性，導致抗菌療效不明顯。因此，研制新型疫苗免疫防治腹水病是一個亟待解決的問題，而尋找保護性抗原表位是生產(chǎn)新型疫苗的基礎(chǔ)[7-8]。擬態(tài)弧菌外膜蛋白U(Outer membrane protein U，OmpU)是一種具有良好抗原性和高度保守性的黏附素蛋白[9-10]

2、，可作為首選疫苗候選分子，但其有效保護性抗原表位至今尚不明確。本研究以純化的兔抗重組OmpUa多克隆抗體為靶標，應(yīng)用噬菌體肽庫技術(shù)篩選和鑒定出擬態(tài)弧菌OmpU蛋白的7個免疫優(yōu)勢模擬表位，并分析了模擬抗原表位的免疫原性和免疫保護性，研究結(jié)果為進一步研制黏附素表位疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 為了獲取用于篩選擬態(tài)弧菌OmpU蛋白的B細胞模擬表位的分子靶標，采用飽和硫酸銨分級沉淀結(jié)合親和層析法提純兔抗重組OmpUa多克隆抗體。純化的兔抗重組

3、OmpUa抗體的純度達到95％，濃度為1.5 mg/mL，ELISA效價高達1:4096000，完全可用于后續(xù)的噬菌體隨機肽庫篩選試驗。
　　 為了篩選鑒定OmpU蛋白的B細胞模擬表位，用純化的兔抗重組OmpUa抗體為篩選靶標，對噬菌體隨機12肽庫進行生物淘洗篩選。經(jīng)過3輪淘洗后，噬菌體的投入產(chǎn)出比呈上升趨勢，噬菌體得到較好富集。隨機挑選68個噬菌體克隆，經(jīng)雙夾心ELISA和競爭ELISA鑒定出9個陽性噬菌體克隆。提取陽性噬菌體

4、克隆單鏈DNA進行序列測定與分析，結(jié)果顯示9個克隆共呈遞HDSSKFPYVPSY、FNLHAWPTLDT、HAATVDKIENMR、GLNWSLSPADLI、DTAYEGNIARLM、FSSDSSKVHYPN和SVSEGMKPSPRP7個12肽序列，它們與OmpU蛋白均無3個以上連續(xù)的相同氨基酸殘基，說明它們是模擬表位。陽性噬菌體克隆C17、C60和C67呈遞共同基序DSSK-P，與OmpU蛋白的氨基酸殘基(293-316aa)有較高同

5、源性，表明D、S、S、K、P是構(gòu)成OmpU蛋白B細胞表位的關(guān)鍵氨基酸。
　　 使用篩選鑒定的7個噬菌體陽性克隆作為抗原分7組免疫昆明小鼠，每組10只，同時做噬菌體原始肽庫陰性對照和擬態(tài)弧菌滅活菌體陽性對照。免疫程序為：腹腔免疫，免疫劑量為1012PFU噬菌體/只，首免后14天二免，二免后10天三免，免疫途徑和劑量均同首免。第3次免疫后7天測定出各組免疫小鼠血清中均產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體，抗體的ELISA效價在1:51200～1

6、:409600之間。攻毒試驗結(jié)果顯示，各組免疫小鼠分別獲得了70％(7/10，C21克隆)、80％(8/1O，C20和C25克隆)和100％(10/10，C17、C24、C60和C66克隆)的免疫保護，而噬菌體M13對照組的小鼠全部死亡。說明7個攜帶OmpU蛋白B細胞模擬表位的噬菌體克隆均具有良好的免疫原性和免疫保護性，C17、C24、C60和C66陽性噬菌體克隆所呈遞的模擬表位可作為疫苗侯選表位。
　　 綜上所述，本研究利用噬