解旋酶RecQL4抗原表位分析及其免疫檢測(cè)技術(shù)的初步建立.pdf

1、Waston和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)后，人們逐步發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶，它是以一條鏈為模板通過(guò)DNA聚合酶聚合形成一條新的鏈?？茖W(xué)家后來(lái)又發(fā)現(xiàn)另一種酶能夠在DNA復(fù)制時(shí)破壞互補(bǔ)堿基對(duì)中的氫鍵，從而使DNA雙螺旋打開(kāi)，這類酶被稱為解旋酶，至今已有上百種解旋酶被發(fā)現(xiàn)。人們根據(jù)解旋酶的二維結(jié)構(gòu)和一級(jí)序列，把解旋酶分為幾大家族來(lái)分類研究。經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)現(xiàn)解旋酶具有多種功能，在細(xì)胞內(nèi)它們參與DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄重組以及RNA接拼、核糖體組

2、裝、蛋白質(zhì)翻譯，端粒穩(wěn)定等。最近，還發(fā)現(xiàn)個(gè)別解旋酶甚至參與機(jī)體天然免疫反應(yīng)機(jī)制。解旋酶已不僅僅只是分開(kāi)核酸雙鏈結(jié)構(gòu)的一類酶，它的生物功能遠(yuǎn)不止此。
　　解旋酶第二大家族中的RecQ解旋酶亞家族在核酸代謝過(guò)程中起了關(guān)鍵的作用。在哺乳動(dòng)物中包含有5個(gè)成員:RecqQL1，WRN，BLM，RecQL4和RecQL5，其中WRN，BLM和RecQL4的突變可分別導(dǎo)致3種常染色隱形遺傳病:布盧姆綜合征，沃納綜合征和Rothmund Thom

3、son Syndrome。特別是RecQL4作為RecQ家族一員由于它在臨床上的發(fā)現(xiàn)它具有雙重作用，即不但其功能缺失促進(jìn)腫瘤高發(fā)，而且其異常的高表達(dá)也可促進(jìn)人類腫瘤的進(jìn)展過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)異常高水平的RecQL4蛋白與前列腺腫瘤細(xì)胞的致瘤性密切相關(guān)。因此做為抗腫瘤藥物研發(fā)及新的腫瘤治療戰(zhàn)略RecQL4具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值?；诖吮狙芯肯Ｍ蒙镄畔W(xué)的方法分析RecQL4抗原表位和研制特異性配對(duì)單克隆抗體，并初步開(kāi)展相關(guān)檢測(cè)產(chǎn)品的研發(fā)

4、。為進(jìn)一步開(kāi)展研究RecQL4表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞相關(guān)性，以及腫瘤對(duì)鉑類或其它種類化療藥物敏感性研究奠定基礎(chǔ)。
　　本項(xiàng)目分別采用生物信息學(xué)的方法獲得RecQL4的多肽抗原，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)確定5條抗原表位多肽的氨基酸序列，并進(jìn)行人工合成。合成的多肽抗原通過(guò)質(zhì)譜鑒定和高效液相純化，純度達(dá)到抗原合成的要求。并把合成多肽與載體蛋白KLH偶聯(lián)，形成免疫抗原。用該5個(gè)抗原免疫Balb/c小鼠，每條多肽抗原分別獲得了一株穩(wěn)定分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)

5、胞株，編號(hào)分別為1B5、2D6、3C8、4D2、5A7。5株單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體Westernblot顯示2D6和5A72個(gè)抗體與Recql4基因工程表達(dá)抗原特異性結(jié)合。2株單克隆抗體純化后的抗體效價(jià)分別為1∶1.24×105、1∶1.24×105，親和力常數(shù)分別為K(2D6)=2.1×109L/moL, K(5A7)=6.7×108L/moL。
　　利用2D6和5A7這2株抗體進(jìn)行膠體金雙抗體夾心檢測(cè)方法初步探討，在膠體金