鉛全抗原的制備及鉛抗體酶聯(lián)免疫檢測體系的建立.pdf

1、鉛是一種具有高蓄積性、多親和性的生理性和神經(jīng)性毒物,各國對食品與環(huán)境中的鉛殘留量均有嚴格的限制。鉛抗原與鉛抗體的制備是建立鉛酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒的基礎和關鍵,本研究運用高度特異性的抗原抗體反應,及免疫競爭結合原理,采用雙功能螯合劑將鉛與牛血清白蛋白(BSA)橋接合成全抗原免疫Balb／c小鼠,對鉛抗體的檢測方法進行優(yōu)化,經(jīng)細胞融合等步驟制備抗鉛單克隆抗體,主要內(nèi)容如下:
　　 1)鉛全抗原的制備
　　 采用雙功能螯合劑

2、[(R)-2-氨基-3-(4-氨基苯基)丙基]-(S-S)環(huán)己烷-1,2二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-Chx-A"-Dtpa)制備重金屬鉛全抗原,分別用戊二醛法,重氮化法等方法,將螯合劑與牛血清蛋白(BSA)連接,再將合成的蛋白螯合劑復合物與鉛離子螯合得到全抗原BSA-P-NH2-Bn-Chx-A”-Otpa-Pb,其中戊二醛法與重氮化法得到的人工抗原,蛋白與鉛的偶聯(lián)比分別為1:15.64與1:42.95(1:42.95抗原為絮狀沉

3、淀物免疫效果不佳)。另外,本研究將戊二醛法予以優(yōu)化,將戊二醛法制備的蛋白螯合劑復合物與鉛離子進行兩步螯合得到抗原BSA-P-NH2-Bn-Chx-A"-Dtpa-Pb,偶聯(lián)率提高到1:20以上。
　　 2)鉛抗體ELISA檢測方法的建立
　　 對間接ELISA檢測方法的實驗條件進行優(yōu)化,建立起高效、快捷、方便的鉛抗體ELISA檢測方法。在初始操作流程的基礎上,對緩沖液種類、緩沖液Ph值,抗原包被時間,抗原包被溫度,等參數(shù)

4、進行優(yōu)化,確定用Ph=7.4的HBS作為緩沖溶液,包被溫度與時間為37℃1h或4℃過夜；通過以上參數(shù)的確定,確定鉛抗體的ELISA檢測體系。
　　 3)抗鉛單克隆抗體的制備與鑒定
　　 將(1)中所制備抗原用于小鼠免疫實驗并通過ELISA檢驗其免疫效果,免疫程序設計上分別做了50μg、100μg兩個免疫劑量對照,并適當增加了免疫次數(shù),四免后小鼠效價最高達到1:102400以上,計算不同包被抗原OD值的差異率達128％,證