擬態(tài)弧菌模擬表位的串聯(lián)表達(dá)及其草魚的免疫應(yīng)答研究.pdf

1、擬態(tài)弧菌可引起水產(chǎn)動物的腹水病,嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,但目前尚無疫苗用于該病預(yù)防。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證實(shí)外膜蛋白U(OmpU)是擬態(tài)弧菌保守性黏附素蛋白之一,該蛋白對實(shí)驗(yàn)小鼠的免疫保護(hù)率為60％。同時(shí),篩選鑒定出OmpU蛋白的6個(gè)免疫優(yōu)勢B細(xì)胞模擬表位,但模擬表位串聯(lián)肽的免疫效應(yīng)尚不清楚。本研究的總體思路是設(shè)計(jì)和表達(dá)OmpU蛋白模擬表位串聯(lián)肽,綜合評價(jià)其免疫效應(yīng),以期獲得免疫保護(hù)效應(yīng)較OmpU蛋白有所提高的多表位肽。
　　

2、首先,根據(jù)OmpU蛋白模擬表位序列及多表位串聯(lián)肽設(shè)計(jì)原則,優(yōu)化設(shè)計(jì)模擬表位串聯(lián)肽。即用AAY(丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸)接頭將已鑒定獲得的OmpU蛋白6個(gè)模擬表位按不同方式串聯(lián),應(yīng)用DNAStarProtean軟件分析各種串聯(lián)方式的可行性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以C25-AAY-C17-AAY-C60-AAY-C20-AAY-C66-AAY-C24方式排列的多表位肽中各表位間相對獨(dú)立,抗原性參數(shù)較好,為最佳串聯(lián)方式。將此多表位串聯(lián)肽序列轉(zhuǎn)化為基因序列,

3、并在基因序列兩端添加酶切位點(diǎn),終止密碼子以及替換稀有密碼子,形成一個(gè)長度為264bp的多表位串聯(lián)基因(命名為6epis基因),委托生物公司克隆至質(zhì)粒pMAL-c4X中。
　　其次,大量制備模擬表位串聯(lián)肽,為綜合評價(jià)其免疫效應(yīng)提供試驗(yàn)材料。應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-6epis,轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),進(jìn)而使用Ni-ChargedResin親合層析柱純化重組蛋白His-6EPIS。經(jīng)SD

4、S-PAGE和Western-blot分析,發(fā)現(xiàn)制備的重組蛋白濃度為1.5mg/mL,純度達(dá)到95%,能與兔抗OmpU抗體發(fā)生特異性反應(yīng),仍保留天然蛋白的抗原性。
　　最后,以制備的重組模擬表位串聯(lián)蛋白、重組OmpU蛋白、標(biāo)簽蛋白和滅活菌苗分別免疫實(shí)驗(yàn)魚,通過測定免疫器官中免疫相關(guān)基因表達(dá)水平、血清抗體產(chǎn)生水平和免疫動物的保護(hù)水平,綜合評價(jià)其免疫效應(yīng)。結(jié)果顯示:(1)6EPIS免疫組草魚頭腎和脾臟中IgMmRNA的表達(dá)水平具有明顯

5、時(shí)間依賴性,免疫后3d開始逐漸升高,至28d達(dá)到高峰,攻毒后頭腎和脾臟中IgMmRNA表達(dá)水平迅速上升,分別較免疫前提高28倍和54倍(p<0.01)。OmpU組、滅活菌組和標(biāo)簽蛋白組草魚免疫后組織中IgMmRNA轉(zhuǎn)錄水平的動力學(xué)與重組6EPIS組相似,兩因素方差分析結(jié)果表明:重組6EPIS組頭腎和脾臟中IgMmRNA轉(zhuǎn)錄整體水平均顯著高于重組OmpU組、滅活菌組和His標(biāo)簽蛋白組的頭腎和脾臟(p<0.05),而重組OmpU組、滅活菌組

6、和His標(biāo)簽蛋白組的IgMmRNA轉(zhuǎn)錄整體水平無顯著差異(p>0.05)。(2)草魚頭腎和脾臟中促炎細(xì)胞因子(IL-1β和TNF-α)mRNA表達(dá)水平于首次免疫和加強(qiáng)免疫后的第1d上調(diào)至極顯著水平(p<0.001),但攻毒后的表達(dá)水平與對照組差異不顯著(p>0.05)。重組6EPIS組促炎細(xì)胞因子的整體轉(zhuǎn)錄水平顯著高于重組OmpU組、滅活菌組和標(biāo)簽蛋白組(p<0.01),且重組OmpU組和滅活菌組均顯著高于標(biāo)簽蛋白組(p<0.01),但

7、兩組之間差異不顯著(p>0.05)。(3)免疫草魚脾臟和頭腎中抗炎性細(xì)胞因子IL-10mRNA表達(dá)水平輕微下調(diào),但在攻毒后,表達(dá)水平顯著上調(diào)(p<0.01),6EPIS組、OmpU組、滅活菌組促炎細(xì)胞因子的整體轉(zhuǎn)錄水平顯著高于標(biāo)簽蛋白組(p<0.01),但是三組之間的差異不顯著(p>0.05)。(4)重組模擬表位串聯(lián)蛋白能夠良好誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生特異性抗體,其免疫后28天瓊擴(kuò)效價(jià)為1:16,同時(shí),OmpU組和滅活菌組的血清抗體效價(jià)為1:4和1