溶藻弧菌DLDH及DTD表達純化及弧菌交叉免疫保護研究.pdf

1、以溶藻弧菌HY9901為模板,參照 GenBank上登錄的其他溶藻弧菌菌株二氫硫辛酰胺脫氫酶基因及 D-酪氨酸-tRNA脫?；富蛐蛄性O(shè)計引物,克隆了溶藻弧菌HY9901菌株的dldh和dtd基因,并對其進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明dldh基因含有一個1428bp的開放閱讀框,編碼475個氨基酸,預(yù)測其相對分子量為50.99 kDa,理論等電點為5.51,Blast分析發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌DLDH與副溶血弧菌同源性高達99％,與哈維氏弧菌高達

2、96%。而dtd基因全長435 bp,編碼144個氨基酸序列,理論分子量為16.09,理論等電點為4.98,Blast分析發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌DTD與副溶血弧菌同源性高達95%,與哈維氏弧菌高達96%。
　　將擴增到的dldh與dtd分別亞克隆到 pET-32a(+)質(zhì)粒中,構(gòu)建pET-DLDH,pET-DTD原核表達質(zhì)粒,并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達。蛋白表達條件優(yōu)化分析,DLDH在37℃,IPTG濃度0.7 mmol/L時誘導(dǎo)

3、4 h蛋白表達量最大,重組蛋白主要以包涵體形式存在;DTD在37℃,0.1 mmol/L的IPTG濃度下誘導(dǎo)5 h時重組蛋白以包涵體形式大量表達。蛋白經(jīng)純化分析,并通過Western blot驗證,表明表達蛋白正確。
　　利用基因的重疊延伸技術(shù),將dldh及dtd兩個基因通過三次PCR技術(shù)拼接到一起形成dldh-dtd,并構(gòu)建原核表達載體,且在大腸桿菌中表達。蛋白表達條件優(yōu)化分析融合蛋白在37℃、IPTG濃度0.4 mmol·L-

4、1誘導(dǎo)4 h時蛋白表達量最高,蛋白主要以包涵體形式存在。利用親和層析技術(shù)對融合蛋白進行純化分析,在咪唑150 mmol·L-1條件下達到最佳洗脫效果,將純化的蛋白進行免疫印跡分析,在NC膜上可見與預(yù)測蛋白相符的清晰條帶,說明融合蛋白成功表達。
　　將表達的DLDH、DTD以及 DLDH-DTD融合蛋白分別免疫斜帶石斑魚,Elisa法檢測抗體效價表明,所有免疫魚均有較高效價,與非免疫對照組差異顯著(P<0.01),各重組蛋白免疫組在

5、第四周時抗體水平達到峰值,而 DLDH-DTD最高,其次為DLDH,DTD抗體水平最低。在三種弧菌攻毒試驗中,DLDH-DTD在溶藻弧菌攻毒下免疫保護率最高(95%),哈維氏弧菌及副溶血弧菌作用下分別為90%;DLDH在溶藻弧菌攻毒下保護率為90%,哈維氏弧菌及副溶血弧菌攻毒下分別為85%;而DTD免疫組相對較低,保護率分別為60%、55%、50%。由此可以認(rèn)為重組蛋白可以作為弧菌交叉疫苗候選蛋白。
　　通過插入突變方法,構(gòu)建dl