溶藻弧菌菌影制備方法改良及菌影對凡納濱對蝦免疫保護機理的研究.pdf

1、隨著凡納濱對蝦養(yǎng)殖密度的提高和抗生素的濫用，依賴傳統(tǒng)的治療手段治療由溶藻弧菌引發(fā)的疾病越來越難，急需新型的治療手段。本論文利用分離的溶藻弧菌及其噬菌體，制備溶藻弧菌菌影；利用福爾馬林制備溶藻弧菌滅活疫苗；通過酚水法提取溶藻弧菌的脂多糖。將這三種制劑通過注射或投喂的方法免疫凡納濱對蝦，觀察其對凡納濱對蝦抗病力的影響。主要研究內(nèi)容和結論如下：
　　1.從湛江市水產(chǎn)品批發(fā)市場下水道水體中分離了一株弧菌，經(jīng)生化鑒定和toxR基因高變區(qū)PC

2、R分子鑒定，確認該菌為溶藻弧菌。
　　2.以分離的溶藻弧菌為宿主菌，從湛江水產(chǎn)品批發(fā)市場下水道污水中分離到一株溶藻弧菌噬菌體。該株噬菌體形成的噬菌斑直徑為1-1.5mm(12h)，對紫外線敏感，暴露在紫外燈(20W，30cm)下30min可喪失全部裂解活性；在pH8-11范圍內(nèi)裂解活性較強，最適pH值為11；裂解周期為65min；對65℃以上的高溫敏感；對乙醚和氯仿有較好的耐受性；對抗病毒藥物阿昔洛韋敏感；其最大常規(guī)稀釋度為106

3、PFU/mL；最佳感染復數(shù)為10。
　　3.向培養(yǎng)12h的菌液中加入福爾馬林，使其終濃度分別為0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％，將混合液分別靜置于4℃、25℃、35℃環(huán)境下以及25℃時放置于回旋振蕩器中搖瓶滅活，再涂平板檢測滅活效果。篩選出比較理想的滅活條件為：在25℃時使用濃度為0.1％的福爾馬林搖瓶滅活12h。用酚水法提取溶藻弧菌脂多糖，產(chǎn)率為0.7529％，得到的脂多糖樣品蛋白含量為22.1μg/mg，多糖含

4、量為190.7μg/mg。向體重為7-9g的凡納濱對蝦分別注射濃度為5mg/mL，4mg/mL，3mg/mL，2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL，的LPS溶液，每尾注射量為0.1mL，當該LPS濃度超過3mg/mL時就具有致死作用。
　　4.溶藻弧菌噬菌體菌影的制作方法：將培養(yǎng)12h的溶藻弧菌用無菌海水洗滌，將其和噬菌體濃縮液按感染復數(shù)MOI=10的比例加入到無菌海水中反應6h。利用細菌數(shù)量與其破碎時釋放于上清液中的核酸

5、含量成線性關系的原理，得到直線方程y=8E+06x-4E+06，在核酸濃度為2.5-9.7μg/mL的范圍內(nèi)，線性關系良好，可以將其作為計算菌影濃度的一種方法。以1:1的比例向菌影懸液中加入大蒜提取液反應3.5h，可除去殘余活菌，用PBS多次洗滌，即可得到溶藻弧菌噬菌體菌影。
　　5.以注射菌影、滅活疫苗、LPS以及投喂菌影的方式免疫凡納濱對蝦。在不同的受免時間攻毒。結果顯示：將菌影以1×107cells/mL的濃度注射免疫凡納濱

6、對蝦，在受免后的24h內(nèi)免疫保護率較強，在受免后的12h時免疫保護率最強，達到53.56％：3者差異不顯著(P>0.05)；將疫苗以1×107cells/mL的濃度注射免疫凡納濱對蝦，在受免后48h，免疫保護率最大為57.14％；將LPS以0.5mg/mL的濃度注射免疫凡納濱對蝦，在受免24h時達到最大免疫保護率為57.14％。
　　投喂菌影免疫凡納濱對蝦后，免疫保護率可隨受免時間的延長而提高，YT2在免疫48h后，免疫保護率達到