溶藻弧菌誘導凡納濱對蝦差減文庫的構建及其表達序列標簽分析.pdf

1、抑制性差減雜交是一個產生差異表達或組織特異性cDNA探針及文庫的高效率的新方法，適用于疾病、發(fā)育、組織特異性和其它差異表達基因的克隆研究。本研究按照Clontech公司PCR-SelectTM cDNA差減雜交試劑盒的說明，建立了基于PCR方法的凡納濱對蝦的差減雜交文庫，用來篩選免疫刺激后表達的免疫相關基因。首先分別提取正常凡納濱對蝦和免疫刺激后對蝦血細胞mRNA，合成雙鏈cDNA，分別稱為driver cDNA和tester cDNA

2、。兩種雙鏈cDNA同時用Rsa I酶切，然后把testercDNA稀釋后在同樣的反應條件下分別與接頭1(Adaptor 1)和接頭2R(Adaptor 2R)連接，driver cDNA不加接頭。接下來是兩次雜交反應，在第二次雜交反應中，只有均化和消減后的單鏈tester cDNA能夠重新雜交，形成新的5'端有不同接頭序列的雜交體。這兩種接頭序列使接下來在用巢式PCR引物1和巢式PCR引物2R兩種引物進行PCR擴增時，差減和均化后的雜交

3、體得到優(yōu)先擴增。第二次PCR的產物與pMD18-T載體連接，轉入DH5α細胞。通過對600個隨機篩選的克隆的測序，用DNAMAN 5.2.2對560條高質量的ESTs進行聚類，共獲得239個Unigenes(164contigs和75singletons)。ESTs與GenBank進行BLASTx和BLASTn同源比較，得出其中33.1％為未知功能基因，66.9％為已知功能基因，GO分類將其分為7類，包括能量和基礎代謝類相關的基因為第一

4、大類占36％，免疫相關基因占15％，其他基因占8％，信號轉導類占3％，抗氧化酶和凋亡相關蛋白均為2％，核蛋白類占1％。與免疫功能相關的表達序列標簽(ESTs)主要有溶菌酶、甲殼酶、α2巨球蛋白、粘蛋白、分子伴侶(熱休克蛋白70/101，Clp B蛋白酶)、轉錄延伸因子1α、轉錄延伸因子3、轉谷氨酰胺酶、磷酸激酶、核糖體蛋白、細胞自溶調節(jié)子、糖酵解和氧化呼吸有關的基因(丙酮酸脫氫酶，磷酸葡萄糖異構酶、細胞色素c氧化酶、氧化酶多肽和NADH