長期低鹽脅迫誘導(dǎo)凡納濱對蝦肝胰腺差異表達(dá)基因的分析和鑒定.pdf

1、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)廣泛分布于太平洋沿岸水域秘魯北部至墨西哥桑諾拉一帶，以厄瓜多爾最為集中。作為一種廣鹽性的甲殼動物，凡納濱對蝦可以適應(yīng)0.5～40的鹽度范圍。近年來，為了緩解海水養(yǎng)殖對沿海環(huán)境的污染并推進(jìn)內(nèi)陸鹽堿地區(qū)養(yǎng)殖的發(fā)展，淡化苗種在內(nèi)陸的低鹽度養(yǎng)殖已經(jīng)成為了水產(chǎn)養(yǎng)殖的一個重要發(fā)展方向，但極低鹽度下養(yǎng)殖的對蝦存在著三個突出問題：生長速度慢、成活率低、免疫力低，對病原菌易感性增高，以上存在的現(xiàn)實(shí)問題

2、制約了低鹽度養(yǎng)殖的推廣。開展長期低鹽養(yǎng)殖對凡納濱對蝦的分子機(jī)理研究，不但可以為進(jìn)一步為甲殼動物生理調(diào)節(jié)提供一定的理論依據(jù)，也為進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平進(jìn)行相關(guān)的研究建立分子水平的檢查平臺。本研究利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了長期低鹽誘導(dǎo)的凡納濱對蝦肝胰腺cDNA文庫，對文庫中拼接的序列進(jìn)行了功能注釋和分類，初步探明了長期低鹽誘導(dǎo)后的凡納濱對蝦差異基因表達(dá)情況，并對篩選到的基因進(jìn)行了長期不同低鹽下轉(zhuǎn)錄水平變化的探討，為從分子水平闡明長期脅迫機(jī)制

3、奠定了基礎(chǔ)。論文主要包括以下幾方面內(nèi)容：
　　 1.首次利用SSH技術(shù)構(gòu)建了長期低鹽誘導(dǎo)下凡納濱對蝦肝胰腺差異表達(dá)cDNA文庫。實(shí)驗(yàn)用凡納濱對蝦初始體重為(0.27±0.01)g，飼養(yǎng)于鹽度2和30中56天，取樣后構(gòu)建肝胰腺不同鹽度養(yǎng)殖下的消減cDNA文庫，隨機(jī)挑選200個(正向80個，反向120個)陽性克隆進(jìn)行測序，成功獲得179個(正向64個，反向115個)ESTs序列，拼接后得到73個Unigenes，包括19個Conti

4、gs(正向7，反向12)和54個Singletons(正向19，反向35)。將正向文庫26條Unigenes和反向文庫的47條Unigenes分別用BlastX和BlastN程序與GenBank上的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(nr)和非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(nt)進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，75.34％的Unigenes(55/73)與公共數(shù)據(jù)庫中已知的基因具有同源性。生物學(xué)信息分析表明，這些Unigenes所代表的相應(yīng)基因的功能包括免疫相關(guān)、代謝相關(guān)、核蛋白、

5、細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移蛋白。這些基因信息也表明凡納濱對蝦在長期低鹽脅迫誘導(dǎo)后，導(dǎo)致的生理變化非常復(fù)雜。文庫中排第一位的是免疫相關(guān)基因，占47.06％(8/17)，其中有5個來自反向文庫，即在長期低滲脅迫中，文庫中的62.5％免疫相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)，以上結(jié)果為低滲脅迫和對蝦免疫力之間的關(guān)系提供了有利的間接證據(jù)，也為對蝦淡化養(yǎng)殖的免疫性能研究提供了研究方向。構(gòu)建的差異表達(dá)cDNA文庫可較好的反映長期低鹽脅迫對凡納濱對蝦影響的基因信息，以上結(jié)果豐富了甲

6、殼動物環(huán)境脅迫研究的基因信息。
　　 2.在長期鹽度脅迫抑制性消減雜交文庫構(gòu)建的基礎(chǔ)上，分析了反向文庫編碼血藍(lán)蛋白、蛻皮類固醇調(diào)節(jié)蛋白、幾丁質(zhì)酶、胰凝乳蛋白酶1和胰蛋白酶5條基因mRNA表達(dá)量的變化情況，同時檢驗(yàn)了這5條基因在短期鹽度變化時(30→2/24h)mRNA表達(dá)量的變化情況。結(jié)果表明，反向文庫中血藍(lán)蛋白、幾丁質(zhì)酶、蛻皮類固醇調(diào)節(jié)蛋白、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶1基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)表達(dá)驗(yàn)證了消減文庫的構(gòu)建是成功的。這5條基因m

7、RNA表達(dá)量在脅迫24小時和56天后表達(dá)量變化明顯不同，說明凡納濱對蝦對長期和短期鹽度脅迫可能采取不同的應(yīng)答策略，以上結(jié)果豐富了甲殼動物環(huán)境脅迫研究的基因信息。
　　 3.在長期鹽度脅迫抑制性消減雜交文庫構(gòu)建的基礎(chǔ)上，探討了長期不同鹽度養(yǎng)殖對凡納濱對蝦(平均體重0.27±0.01 g)生長性能和脅迫響應(yīng)相關(guān)基因(血藍(lán)蛋白、幾丁質(zhì)酶、蛻皮類固醇調(diào)節(jié)蛋白、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶1)轉(zhuǎn)錄水平的影響，以期從分子機(jī)理上了解凡納濱對蝦長期低

8、鹽養(yǎng)殖生長性能和生理狀態(tài)的關(guān)系。結(jié)果表明，降低鹽度到一定程度可顯著降低凡納濱對蝦的生長性能和成活率；不同的基因存在不同的鹽度誘導(dǎo)范圍；相對于海水對照組，血藍(lán)蛋白和胰凝乳蛋白酶1轉(zhuǎn)錄水平與鹽度呈正相關(guān)，因此，以上幾種基因轉(zhuǎn)錄水平反映長期鹽度脅迫的強(qiáng)度。
　　 4.本文利用SSH和RACE(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)，克隆了凡納濱對蝦兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶(Catechol-O

9、-methyltransferase，COMT，E.C.2.1.1.6)基因。該基因(LvCOMT)cDNA全長910bp(GenBank登錄號：JQ345478)，編碼221個氨基酸，理論分子量74.9kDa，等電點(diǎn)4.98。經(jīng)軟件分析該成熟肽有12個磷酸化的氨基酸位點(diǎn)，不具信號肽，推測凡納濱對蝦COMT基因可能是依賴12個可能的氨基酸發(fā)生可逆的的磷酸化反應(yīng)來進(jìn)行調(diào)控作用的。LvCOMT基因與斑節(jié)對蝦和中國明對蝦的氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶具有

10、高度的相似性，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，LvCOMT在親緣關(guān)系上更接近于哺乳動物的兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶。應(yīng)用RQ-PCR分析COMT在凡納濱對蝦中的組織特異性分布，結(jié)果顯示COMT在肝胰腺組織中表達(dá)量最高，在鰓中的表達(dá)量最低。
　　 5.克隆了凡納濱對蝦對鹽度脅迫應(yīng)答的重要伴侶蛋白基因-鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)基因(GenBank登錄號：JQ682618)。LvCRT基因cDNA全長1866bp，編碼406個氨基