溶藻弧菌ompW基因的克隆表達(dá)及DNA疫苗的研制.pdf

1、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)屬弧菌科(Vibrionaeeae)，弧菌屬(Vibrio)，是一種嗜溫性、嗜鹽性的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于世界各地海水及河口處、海洋動物中，是引起海水養(yǎng)殖魚、蝦、貝類爆發(fā)性弧菌疾病的主要病原之一。DNA疫苗作為第三代疫苗在水產(chǎn)中的研究已具有悠久的歷史，并取得卓越的成效，對溶藻弧菌DNA疫苗的研究將為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供一條可行之道。 本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室從湛江養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)分離保存

2、得到的溶藻弧菌有毒株為研究對象，以該菌基因組為模板，采用改進(jìn)后的熱不對稱交錯PCR(ThermalAsymmetric Interlaced PCR；TAIL-PCR)從基因組中擴(kuò)增到ompW基因片段，將得到的片段與載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到DH5α桿菌中，經(jīng)藍(lán)白斑、抗性篩選、菌液PCR鑒定陽性克隆，將陽性克隆送生物公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明：獲得ompW基因全長。獲得的全長與GcnBank database中溶藻弧菌菌株外膜蛋白W序列進(jìn)行同

3、源性分析，所得到序列同其他序列的同源性高達(dá)98％。 將經(jīng)雙酶切后的全長序列與原核表達(dá)載體pET-21a進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)抗性篩選、菌液PCR鑒定的陽性克隆送生物公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析得到重組蛋白表達(dá)的優(yōu)化條件：在37℃，0.7mmol/L IPTG的濃度下誘導(dǎo)4h，重組蛋白能得到大量表達(dá)。以鎳親和層析柱純化后的重組蛋白與本實(shí)驗(yàn)室自制的兔抗溶藻弧菌血

4、清進(jìn)行western-blot，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所得到的重組蛋白與抗血清特異性結(jié)合能力強(qiáng)。 以EcoR I/Xho I對ompW序列與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)進(jìn)行雙酶切，并在T4連接酶的作用下構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA-ompW.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α，測序正確后，擴(kuò)大培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒。以O(shè).1mol/LPBS稀釋質(zhì)粒后按每尾魚25μL，的劑量(含有質(zhì)粒5μg)對眼斑擬石首魚進(jìn)行免疫，以注射相同劑量的空pcDNA3.1(