溶藻弧菌ompW基因的克隆表達及DNA疫苗的研制.pdf

1、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)屬弧菌科(Vibrionaeeae)，弧菌屬(Vibrio)，是一種嗜溫性、嗜鹽性的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于世界各地海水及河口處、海洋動物中，是引起海水養(yǎng)殖魚、蝦、貝類爆發(fā)性弧菌疾病的主要病原之一。DNA疫苗作為第三代疫苗在水產(chǎn)中的研究已具有悠久的歷史，并取得卓越的成效，對溶藻弧菌DNA疫苗的研究將為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供一條可行之道。 本實驗以實驗室從湛江養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)分離保存

2、得到的溶藻弧菌有毒株為研究對象，以該菌基因組為模板，采用改進后的熱不對稱交錯PCR(ThermalAsymmetric Interlaced PCR；TAIL-PCR)從基因組中擴增到ompW基因片段，將得到的片段與載體進行連接，轉化到DH5α桿菌中，經(jīng)藍白斑、抗性篩選、菌液PCR鑒定陽性克隆，將陽性克隆送生物公司進行測序。測序結果表明：獲得ompW基因全長。獲得的全長與GcnBank database中溶藻弧菌菌株外膜蛋白W序列進行同

3、源性分析，所得到序列同其他序列的同源性高達98％。 將經(jīng)雙酶切后的全長序列與原核表達載體pET-21a進行連接，構建重組質(zhì)粒，經(jīng)抗性篩選、菌液PCR鑒定的陽性克隆送生物公司進行測序，測序結果正確后將重組質(zhì)粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達，經(jīng)實驗分析得到重組蛋白表達的優(yōu)化條件：在37℃，0.7mmol/L IPTG的濃度下誘導4h，重組蛋白能得到大量表達。以鎳親和層析柱純化后的重組蛋白與本實驗室自制的兔抗溶藻弧菌血

4、清進行western-blot，實驗結果表明所得到的重組蛋白與抗血清特異性結合能力強。 以EcoR I/Xho I對ompW序列與真核表達載體pcDNA3.1(+)進行雙酶切，并在T4連接酶的作用下構建重組真核表達載體pcDNA-ompW.重組質(zhì)粒轉入DH5α，測序正確后，擴大培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒。以O.1mol/LPBS稀釋質(zhì)粒后按每尾魚25μL，的劑量(含有質(zhì)粒5μg)對眼斑擬石首魚進行免疫，以注射相同劑量的空pcDNA3.1(