創(chuàng)傷弧菌DNA疫苗載體的構建及表達分析.pdf

1、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus），又名海洋弧菌，其屬于弧菌屬，是一種革蘭氏陰性，嗜鹽性的桿狀細菌，常存在于海鮮與海水中，能引起水產(chǎn)魚類疾病。鰻鱺感染此菌可引起出血病，且發(fā)病速度快，死亡率高，對鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前防治此病主要是使用廣譜類抗菌藥物，基于食品安全和環(huán)境保護的理念，研發(fā)相關特異性疫苗已迫在眉睫。本研究以創(chuàng)傷弧菌FJ03-X2株的脂蛋白Lpp和外膜蛋白OmpK為目的基因，構建了創(chuàng)傷弧菌DNA疫苗真核表

2、達載體pcDNA3-lpp和pcDNA3-ompk，并在真核細胞中檢測到目的基因的表達，具體如下：
　　FJ03-X2株為本實驗室于2003年在福建長樂某鰻鱺場分離、鑒定和保存。根據(jù)GenBank記載創(chuàng)傷弧菌ATCC29307株lpp基因序列和創(chuàng)傷弧菌1.1758株ompk基因序列，設計引物，首次克隆到創(chuàng)傷弧菌FJ03-X2株的lpp和ompk基因。利用在線網(wǎng)絡分析兩種蛋白的親疏水性，抗原表位、糖基化位點、磷酸化位點和二級結構。構

3、建pMD18-T-lpp和pMD18-T-ompk重組質粒，獲得基因片段。
　　構建原核表達重組質粒pET-32a-lpp和pET-32a-ompk，轉化E.coliBL21（DE3）表達蛋白。SDS-PAGE電泳檢測，加上標簽后，Lpp蛋白大小為47kDa，OmpK蛋白大小為45kDa，符合預期結果。純化目的蛋白，并免疫SPF級SD大鼠，獲得大鼠多克隆抗血清。ELISA檢測血清效價，鼠抗Lpp蛋白血清和鼠抗OmpK蛋白血清效價均

4、為1:128000。免疫印記實驗證明多克隆抗血清可識別創(chuàng)傷弧菌的脂蛋白Lpp和外膜蛋白OmpK。經(jīng)檢測，兩種抗血清均具有較高的特異性。
　　構建創(chuàng)傷弧菌DNA疫苗真核表達載體pcDNA3-lpp和pcDNA3-ompk。將帶有目的基因的質粒與pEGFP-N1（綠色熒光蛋白基因）以10:1的比例，通過脂質體共轉染293細胞，48h后觀察綠色熒光蛋白的表達，并通過RT-PCR檢測目的基因mRNA水平的表達，Western-blot檢測