新型可復(fù)制型腎癌治療性DNA疫苗的構(gòu)建及表達.pdf

1、研究背景:
　　腎癌是當(dāng)今社會人們面臨的危害人類健康的重要疾病,特別是對失去手術(shù)機會的轉(zhuǎn)移性腎癌目前還沒有令人滿意的治療方法,其他方法諸如放療,化療或內(nèi)分泌治療對腎癌治療效果比較局限,細胞因子等雖然會對部分病人有療效,但是強烈的毒副作用影響了它的應(yīng)用。因此,晚期腎癌的治療迫切需要新的更加有效的治療方法。
　　研究目的:
　　本研究是將腎癌G250抗原與一種基于塞姆利基森林病毒(SFV)的載體共同構(gòu)建成為新型的腎癌疫苗p

2、SVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7,并構(gòu)建表達人G250基因的renca細胞系小鼠荷瘤模型,為后續(xù)的抑瘤活性研究及免疫學(xué)機制研究打下堅實的基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1,將本室驗證具有良好抗腫瘤活性的DNA疫苗中克隆出異種化G250融合基因片段,克隆入pSVK載體,構(gòu)建成新型的可復(fù)制型腎癌治療性DNA疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7。質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染293T細胞后用We

3、sternBlot驗證其在體外培養(yǎng)細胞中的表達能力,通過肌肉注射加上電脈沖刺激的方法免疫小鼠,剝?nèi)∶庖卟课患∪饨M織進行免疫組化分析,對其活體內(nèi)抗原的表達進行驗證。
　　2,采用PCR擴增出人的G250基因編碼區(qū)長度的互補序列,根據(jù)DNA重組技術(shù)定向插入到pIRES-neo真核表達載體中,得到重組表達質(zhì)粒pIRES-neo-G250。用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將該質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到小鼠renca細胞中,通過調(diào)整G418的濃度篩選出陽性的克隆,

4、用蛋白免疫印跡和免疫熒光測試驗證人G250基因轉(zhuǎn)染小鼠renca細胞株后的表達情況,利用上述細胞株分別以不同的濃度接種Balb/c小鼠,觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源基因后renca細胞的致瘤能力,建立表達人G250的小鼠腎癌模型。
　　結(jié)果:
　　(1)成功構(gòu)建了新型可復(fù)制型腎癌治療性DNA疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7,利用westernblot及免疫組化的方法對該疫苗的體內(nèi)外表達進行了驗證,結(jié)果

5、表明有良好的表達。(2)成功篩選出了穩(wěn)定表達人G250基因的小鼠renca細胞株,利用westernblot,RT-PCR,流式細胞術(shù)及免疫熒光法檢測了抗原分子的表達,并建立了表達人G250的小鼠腎癌模型,為后期研究新型可復(fù)制型腎癌治療性DNA疫苗pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7的抑瘤作用提供了實驗依據(jù)。
　　討論:
　　綜上所述,所構(gòu)建的新型可復(fù)制性抗腫瘤DNA疫苗pSVK-sig-tG25