可復(fù)制型甲病毒顆粒疫苗的制備及其DC靶向化初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，國際上逐步發(fā)展起了一種新的基因疫苗載體系統(tǒng)，稱為復(fù)制型DNA疫苗，克服了常規(guī)DNA疫苗免疫力低下、安全方面不能保障的缺陷，同時又保留了DNA疫苗穩(wěn)定、低成本的優(yōu)點(diǎn)，因而成為開發(fā)治療性疫苗最好的技術(shù)途徑之一。
　　 本研究室前期自主開發(fā)了基于塞姆利基森林病毒SFV的復(fù)制子DNA疫苗載體系統(tǒng)(可復(fù)制型DNA疫苗)，并用于腫瘤疫苗及乙肝疫苗等新型治療性基因疫苗的研究。所謂可復(fù)制型DNA疫苗，是在RNA復(fù)制子疫苗基礎(chǔ)上發(fā)展演化而

2、來的一種新型DNA疫苗系統(tǒng)。與常規(guī)DNA疫苗相比，可復(fù)制型DNA疫苗利用RNA復(fù)制酶，在細(xì)胞中具有自我復(fù)制能力，介導(dǎo)RNA復(fù)制子在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行大量自我復(fù)制，因此外源基因可以得到高效表達(dá)。同時RNA大量自我復(fù)制過程中，產(chǎn)生的雙鏈RNA是強(qiáng)效天然免疫佐劑，使可復(fù)制型DNA疫苗免疫效力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)DNA疫苗，用量可降低到傳統(tǒng)DNA疫苗的100倍以下。再有，該疫苗的自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄表達(dá)均發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)中，最終會誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡，從而消除了與宿主細(xì)

3、胞基因組整合的危險性，大大提高了基因疫苗的安全性。而且，這種疫苗以類似脈沖的形式刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，能夠有效克服免疫耐受。
　　 為了進(jìn)一步提高復(fù)制子DNA疫苗抗原的遞送效率和免疫效果，本研究將復(fù)制子載體包裝成為甲病毒顆粒樣疫苗，同時還對所制備顆粒進(jìn)行DC靶向化改造。病毒顆粒這種疫苗形式，除了具備復(fù)制子疫苗的全部優(yōu)點(diǎn)外，還可以使其包裝的復(fù)制子DNA免受核酸酶的降解，增強(qiáng)抗原進(jìn)入細(xì)胞的效率，充分發(fā)揮病毒樣顆粒本身的免疫學(xué)特性。同時，

4、通過對這種重組的甲病毒顆粒疫苗進(jìn)行DC靶向化改造，在體內(nèi)選擇性感染DC細(xì)胞，進(jìn)一步增強(qiáng)DC細(xì)胞對抗原的吞噬、加工和遞呈功能，從而提高疫苗激發(fā)特異性免疫應(yīng)答的效果，最終提高疫苗的免疫效力。
　　 首先，本研究以基于SFV的含有紅綠熒光蛋白報告基因的復(fù)制子DNA表達(dá)載體pSCK-EGFP-IRES-dsRED為基礎(chǔ)，通過與輔助載體pSHCAR共轉(zhuǎn)染，由pSHCAR提供結(jié)構(gòu)蛋白，制備表達(dá)紅綠熒光蛋白報告基因的重組病毒顆粒，并驗(yàn)證其表達(dá)

5、能力。同時，通過實(shí)驗(yàn)，比較單獨(dú)pSCK-EGFP-IRES-dsRED質(zhì)粒和所制備的含有紅綠熒光蛋白報告基因的重組病毒顆粒的表達(dá)能力。通過調(diào)整共轉(zhuǎn)染時復(fù)制子表達(dá)載體和輔助載體的比例，并計(jì)算病毒滴度，初步摸索甲病毒包裝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。通過檢測報告基因的表達(dá)情況初步可以看出重組病毒顆粒表達(dá)效率比單獨(dú)轉(zhuǎn)染pSCK-EGFP-IRES-dsRED質(zhì)粒要高，所制備的重組病毒滴度能夠達(dá)到6.5×105IU/mL。通過對比在共轉(zhuǎn)染時復(fù)制子DNA表達(dá)載

6、體和輔助載體的摩爾比為1：1或者是質(zhì)量比為1:1，經(jīng)過檢測紅綠熒光蛋白報告基因，得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是：共轉(zhuǎn)染時可復(fù)制型DNA表達(dá)載體和輔助載體的質(zhì)量比為1:1時，能得到更高滴度的病毒顆粒。
　　 在上述研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對本室前期構(gòu)建的HBV復(fù)制子DNA疫苗pSCK-HBV-Fc-GPI-IRES-GM/B7進(jìn)行病毒樣顆?；b研究。將pSCK-HBV-Fc-GPI-IRES-GM/B7質(zhì)粒與輔助載體共轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，收集細(xì)胞培

7、養(yǎng)上清，制備HBV復(fù)制子病毒顆粒疫苗，并通過流式細(xì)胞儀和免疫熒光檢測HBV復(fù)制子病毒顆粒疫苗的表達(dá)能力。初步結(jié)果可以看出，HBV復(fù)制子病毒顆粒疫苗能夠在細(xì)胞中表達(dá)，經(jīng)病毒滴度測定，制備的重組病毒滴度達(dá)到1.5×105IU/mL。
　　 然后，我們借鑒國外的最新研究，以基于SFV(塞姆利基森林病毒)的可復(fù)制型病毒顆粒疫苗為基礎(chǔ)，對其進(jìn)行DCs靶向化研究。主要工作就是對基于SFV的輔助載體pSHCAR進(jìn)行DC靶向化改造，使其輔助包裝

8、的病毒顆粒能特異性地結(jié)合DC表面分子DC-SIGN，從而實(shí)現(xiàn)病毒顆粒疫苗對DC細(xì)胞的特異性感染，進(jìn)一步提高抗原遞呈效率。最后對改造后的輔助載體進(jìn)行表達(dá)和包裝能力的初步驗(yàn)證。初步結(jié)果證實(shí)：改造后的輔助載體pSHCAR工具有較好的表達(dá)能力，通過RT-PCR檢測手段證明改造后的輔助載體具有包裝并形成病毒的能力，并且通過與復(fù)制子表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染能提高復(fù)制子表達(dá)載體的表達(dá)率。
　　 為了進(jìn)行重組甲病毒顆粒體外DC靶向化實(shí)驗(yàn)研究，本實(shí)驗(yàn)還構(gòu)建

9、了能夠穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN分子的BHK21細(xì)胞系。通過構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES-neo-DC-SIGN，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，以G418進(jìn)行陽性克隆的篩選，通過有限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN分子的BHK21細(xì)胞系，利用流式細(xì)胞儀、Western印跡及免疫熒光法檢測DC-SIGN分子的表達(dá)，最終成功構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)人DC-SIGN分子的BHK21細(xì)胞系，為接下來DC靶向化重組甲病毒顆粒體外實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。