人乳頭瘤病毒(HPV)混合型病毒樣顆粒疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、宮頸癌是世界第二大高發(fā)婦科腫瘤，慢性持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus，HPV）感染是宮頸癌的主要誘因。目前已發(fā)現(xiàn)了包括HPV16，-18，-45等合計(jì)15種高危型HPV，其中HPV16，-18是全球范圍優(yōu)勢(shì)流行的病毒株，因此國(guó)外上市的兩種預(yù)防宮頸癌的病毒樣顆粒（VLP）疫苗都只包含HPV16，-18兩種型別，可預(yù)防HPV16，-18感染相關(guān)的約70％的宮頸癌。而其它高危型的流行情況在各個(gè)地區(qū)的有一定的差異

2、。在我國(guó)，除HPV16，-18是誘發(fā)宮頸癌的優(yōu)勢(shì)流行病毒株之外（檢出率分別為58.7％和11％），HPV58的感染率也很高（7.2％），居于第三位，其它如HPV33，-52，-31的檢出率也都在2％以上，其中HPV33，-52的檢出率比歐美地區(qū)相應(yīng)型別的檢出率高。因此，在HPV16，-18的基礎(chǔ)上繼續(xù)增加包括HPV58在內(nèi)的我國(guó)其它主要優(yōu)勢(shì)流行病毒型別，研發(fā)相應(yīng)的多價(jià)L1 VLP混合型疫苗對(duì)于預(yù)防我國(guó)婦女宮頸癌的發(fā)生具有重要意義。

3、>　　 本研究利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)體系，首先通過(guò)聯(lián)合采用偏性密碼子、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)整等多種策略優(yōu)化改造HPV16，-18，-58病毒主要外殼蛋白L1基因，分別構(gòu)建高滴度重組桿狀病毒，感染昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)L1 VLP，分離純化HPV16，-18，-58 L1 VLP。然后采用不同的配伍方案，包括劑量配伍及聯(lián)合佐劑配伍等方案，配制HPV16，-18，-58 L1 VLP多價(jià)疫苗，肌肉免疫BALB/c小鼠，通過(guò)VLP-ELISA檢測(cè)免

4、疫血清VLP結(jié)合抗體的水平及持續(xù)時(shí)間，通過(guò)假病毒中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)評(píng)價(jià)血清中和抗體的水平。在分析VLP混合免疫同時(shí)誘發(fā)針對(duì)疫苗組分型別特異性體液免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)分析混合免疫是否存在免疫干擾，并探討分析誘發(fā)免疫干擾的相關(guān)因素及克服方法，確立HPV16，-18，-58 L1 VLP混合型多價(jià)疫苗的最佳免疫方案。結(jié)果如下：
　　 1.HPV16，-18，-58 L1改造基因的重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞后，SDS-PAGE考馬斯亮蘭染色及

5、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L1改造基因可在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高水平表達(dá)，L1重組蛋白純化后經(jīng)電鏡分析均可自組裝成大小及形態(tài)與天然病毒類似的病毒樣顆粒。
　　 2.按照每種型別VLP5μg的劑量，配制HPV16，-18，-58 L1 VLP三價(jià)疫苗，同時(shí)設(shè)HPV16，-18，-58，-6，-11 L1 VLP五價(jià)疫苗及相應(yīng)單價(jià)疫苗為對(duì)照組。VLP-ELISA法檢測(cè)分析結(jié)果表明，混合免疫可同時(shí)誘發(fā)針對(duì)疫苗組分型別的高水平VLP-EL

6、ISA結(jié)合抗體，兩次免疫后HPV16，-18，-58 L1 VLP結(jié)合抗體的滴度分別高達(dá)2×104，2.5×104，2.5×104，三次免疫后針對(duì)這三種型別的結(jié)合抗體滴度分別高達(dá)3.1×104，6.3×104，6.3×104，均可持續(xù)至少一年時(shí)間，且各型VLP結(jié)合性抗體滴度在混合免疫組及單獨(dú)免疫組之間沒(méi)有顯著差異；假病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，混合免疫血清可同時(shí)中和HPV16，-18，-58型假病毒，阻止其報(bào)告基因的表達(dá)，兩次免疫后針對(duì)HPV

7、16，-18，-58假病毒中和抗體滴度分別高達(dá)4.5×103，104，2.9×103，三次免疫后針對(duì)這三種型別的中和抗體滴度分別高達(dá)1.5×104，1.5×104，4.5×103，但混合免疫組誘發(fā)產(chǎn)生的針對(duì)HPV16，-18，-58的中和抗體均較其相應(yīng)的單獨(dú)免疫組的低，且五價(jià)免疫組誘發(fā)的中和抗體水平較三價(jià)免疫組進(jìn)一步降低。表明混合免疫型別之間存在免疫干擾現(xiàn)象。
　　 3.在HPV16，-18 L1 VLP配伍劑量為5μg不變的情

8、況下，將HPV58 L1 VLP的劑量增加至10μg，混合后肌肉免疫。免疫血清中和活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)增加HPV58 VLP的劑量可部分消除對(duì)HPV58型的免疫干擾，但對(duì)HPV16，-18型的免疫干擾有所增強(qiáng)。
　　 4.在HPV16，-18，-58 L1 VLP每種型別劑量均為5μg的情況下，將其中一種型別的VLP在小鼠一側(cè)后肢肌肉免疫，另外兩種混合后在另一側(cè)后肢免疫。免疫血清中和活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分為點(diǎn)免疫可以減弱對(duì)單獨(dú)免疫型別的免疫干

9、擾現(xiàn)象，但不能完全消除免疫干擾。
　　 5.將每種型別的VLP劑量降低到0.1μg，配制HPV16，-18，-58 L1 VLP三價(jià)疫苗，同時(shí)設(shè)HPV16，-18 L1 VLP雙價(jià)疫苗，HPV16，-18，-58，-6，-11 L1 VLP五價(jià)疫苗及相應(yīng)單價(jià)疫苗為對(duì)照組。假病毒中和實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示，低劑量混合免疫可同時(shí)誘發(fā)針對(duì)HPV16，-18，-58的中和抗體，兩次免疫后中和抗體滴度分別為4×102，2×102，4×102，對(duì)

10、疫苗中所有型別的免疫干擾現(xiàn)象均有所減弱，但免疫干擾程度仍隨著疫苗中抗原價(jià)次的增加而增強(qiáng)。
　　 6.將氫氧化鋁佐劑按比例與低劑量（每型0.1μg）VLP混合，配制復(fù)合有佐劑的多價(jià)疫苗，包括HPV16，-18雙價(jià)疫苗，HPV16，-18，-58三價(jià)疫苗及HPV16，-18，-58，-6，-11五價(jià)疫苗。免疫血清中和活性分析發(fā)現(xiàn)，低劑量組復(fù)合佐劑免疫后產(chǎn)生的干擾現(xiàn)象較單純低劑量免疫組的低，并且免疫干擾隨疫苗中抗原價(jià)次增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)

11、變得不明顯。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合采用偏性密碼子、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)整的方法自主優(yōu)化獲得的HPV L1基因能在桿狀病毒.昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)體系內(nèi)高水平表達(dá)生產(chǎn)L1 VLP，HPV16，-18，-58 L1 VLP混合免疫可同時(shí)誘發(fā)針對(duì)疫苗組分型別的高水平中和抗體，并首次發(fā)現(xiàn)HPV VLP混合免疫時(shí)會(huì)產(chǎn)生免疫干擾，增加某一型別的免疫劑量可部分克服對(duì)這種型別免疫干擾，但會(huì)增加對(duì)其它型別的免疫干擾，降低免疫劑量及聯(lián)合使用佐劑