PRRSV病毒樣顆粒的組裝與DNA疫苗研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種以母豬繁殖障礙及仔豬呼吸道癥狀和高死亡率為特征的病毒性傳染病。自1987年首次在美國出現(xiàn)以來，一直是世界養(yǎng)豬業(yè)防控的難題。而在我國自2006年夏季以來高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株的出現(xiàn)和流行更是給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了難以估量的損失。
　　 PRRSV GP5蛋白是由ORF5基因編碼，是其主要的免疫保護(hù)性蛋白，GP5和M蛋白共表達(dá)能夠形成異源二聚體，且這種異源二聚體能夠促進(jìn)GP5蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向

2、高爾基體轉(zhuǎn)運，從而增強GP5蛋白所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。而N蛋白是PRRSV含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，也是免疫原性最強的病毒蛋白，雖然N蛋白所誘導(dǎo)的抗體不具備中和病毒的能力，但N蛋白能誘發(fā)機體產(chǎn)生強勁的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　 病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)在形態(tài)上與天然病毒粒子相同或相似，因此具有很好的免疫原性，同時由于其不含病毒核酸，所以安全性高，在疫苗研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)因其表達(dá)外

3、源蛋白的含量高且安全性強而被廣泛用于VLPs組裝的研究。
　　 為了獲得更加安全高效的PRRSV基因工程疫苗，本研究構(gòu)建了共表達(dá)PRRSVGP5，M和N蛋白的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，并在小鼠模型上對其免疫原性進(jìn)行了評價，同時以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)初步探討了參與組裝PRRSV病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白。主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 利用PCR和酶切的方法將PRRSV WUH3株的ORF5、ORF6、O

4、RF7插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1中，構(gòu)建了單獨表達(dá)GP5蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF5、共表達(dá)GP5和M蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF5/6和共表達(dá)GP5、M和N蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF5/6/7，并經(jīng)Western blot證實各表達(dá)質(zhì)粒在體外培養(yǎng)細(xì)胞中均能有效表達(dá)目的蛋白。
　　 2.PRRSV GP5-ELISA的建立
　　 將實驗室構(gòu)建的表達(dá)GP5蛋白的原核表達(dá)質(zhì)

5、粒pKG-ORF5轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，提取包涵體并純化，進(jìn)行SDS-PAGE分析，得到大小為38KD的重組GST-GP5，以該蛋白為抗原建立了檢測GP5特異性抗體的ELISA方法。
　　 3.重組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠后誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)
　　 為了探討N蛋白能否增強GP5和M蛋白的免疫原性，將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF5、pcDNA3.1-ORF5/6和pcDNA3.1-ORF5/6/7以及空白載

6、體pcDNA3.1分別免疫BALB/c小鼠，進(jìn)行體液免疫反應(yīng)的評價，結(jié)果GP5和M蛋白共表達(dá)的質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF5/6及GP5、M和N蛋白共表達(dá)的質(zhì)粒pcDNA3.1-ORF5/6/7所誘導(dǎo)的中和抗體和針對GP5蛋白的ELISA抗體均顯著高于單獨表達(dá)GP5蛋白的pcDNA3.1-ORF5免疫組，但pcDNA3.1-ORF5/6免疫組和pcDNA3.1-ORF5/6/7免疫組所誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)無顯著差異。
　　 4.重

7、組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠后誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)
　　 在DNA疫苗免疫后第5周，斷頸處死小鼠，分離脾淋巴細(xì)胞，經(jīng)滅活的PRRSV刺激后，熒光定量和ELISA檢測IFN-γ的表達(dá)，結(jié)果GP5和M蛋白共表達(dá)及GP5、M和N蛋白共表達(dá)所誘導(dǎo)的IFN-γ水平均顯著高于單獨表達(dá)GP5的質(zhì)粒所誘導(dǎo)的IFN-γ水平，而GP5、M和N蛋白共表達(dá)的質(zhì)粒所誘導(dǎo)的IFN-γ水平又顯著高于GP5和M蛋白共表達(dá)質(zhì)粒的免疫組(P<0.05)，研究表明，GP5、

8、M和N蛋白共表達(dá)能增強細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　 5.桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)介導(dǎo)的PRRSV病毒樣顆粒組裝的研究
　　 將本實驗室構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-ORF5/6、pFastBac-ORF5/6/7和pFastBac-ORF2/5/6/7分別轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌，獲得重組Bacmid-ORF5/6、Bacmid-ORF5/6和Bacmid-ORF5/6，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒BV-ORF5/6、B