人乳頭瘤病毒16型E6E7基因疫苗的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)屬乳多空病毒科，是一類特異感染人皮膚和粘膜的雙鏈閉合環(huán)狀DNA病毒，具有種屬特異性，不能在培養(yǎng)基中生長，主要感染人體表皮細(xì)胞或黏膜上皮，引起感染部位發(fā)生病變。目前已分離出100多型HPV，分為低危型和高危型。低危型主要有6，11，34，44型等，與粘膜上皮的良性腫瘤有關(guān)，主要導(dǎo)致乳頭狀瘤，尖銳濕疣，低度子宮上皮內(nèi)瘤變等，高危型有16，18，31，33，35，39型等，與宮頸

2、癌密切相關(guān)，90％以上的宮頸癌組織中可以檢測(cè)到HPV，其中HPV16所占比例最高檢測(cè)率超過50％，所以，在疫苗研發(fā)中主要針對(duì)HPV16的研究，對(duì)宮頸癌的預(yù)防及治療具有十分重要的意義。
　　 HPV基因分為3部分，早期基因(E區(qū))、晚期基因(L區(qū))、無編碼的長控制區(qū)(Long Control region，LCR)。E區(qū)有6個(gè)開放性閱讀框架(E1、E2、E4、E5、E6、E7)，其中高危HPV的E6、E7編碼蛋白是使正常細(xì)胞惡變的

3、主要轉(zhuǎn)化蛋白，共同促進(jìn)病毒復(fù)制，使感染細(xì)胞持續(xù)性增生，并使腫瘤抑制基因失效，HPV E6與抑癌基因p53作用，使其失去在細(xì)胞周期中的DNA糾錯(cuò)功能，HPV E7則抑制pRb，進(jìn)而激活誘導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞周期持續(xù)循環(huán)的基因，使其組織持續(xù)增生，E6、E7基因在宮頸癌持續(xù)發(fā)展中起重要作用。研制安全、有效、經(jīng)濟(jì)的HPV疫苗，對(duì)于防治宮頸癌具有十分重要的意義。
　　 本研究成功構(gòu)建了以HPV16E6E7基因重組質(zhì)粒pcDNA-E6E7，免疫小鼠，

4、評(píng)價(jià)HPV16E6E7基因疫苗的免疫效應(yīng)。方法：酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-E6E7，將E6E7基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)中，構(gòu)建HPV16E6E7基因重組質(zhì)粒pcDNA-E6E7，經(jīng)限制性內(nèi)切酶和序列檢測(cè)鑒定后轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，通過IFA法驗(yàn)證HPV16E6E7能在體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞中暫態(tài)表達(dá)。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒經(jīng)大量制備和純化后，以聚乙烯胺(polyethylenimine，PEI)為佐劑包裹，肌肉注射6周齡BAB

5、L/c小鼠,同時(shí)設(shè)原載體pcDNA3.1(-)和生理鹽水為對(duì)照組，每隔2周注射一次，共注射3次，在最后一次免疫后兩周在小鼠眼底靜脈采血，分離血清，IFA法分析基因免疫在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。結(jié)果構(gòu)建的HPV16E6E7基因重組質(zhì)粒pcDNA-E6E7，能在COS-7細(xì)胞中暫態(tài)表達(dá)，免疫小鼠的血清中可檢測(cè)到抗E7抗體，而原載體pcDNA3.1(-)和生理鹽水注射后，未檢測(cè)出特異的抗E7抗體；通過ELISA定量檢測(cè)細(xì)胞因

6、子IL-2和IFNγ分泌情況，實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生的IL-2明顯高于對(duì)照組與空白組，P＜0.01；實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生的IFNγ明顯高于對(duì)照組與空白組，P＜0.05各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明構(gòu)建的HPV16E6E7基因疫苗能夠在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中暫態(tài)表達(dá)，免疫小鼠后通過IFA法和ELISA定量檢測(cè)分析該疫苗株可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　 本文通過HPV16E6E7的基因疫苗的基礎(chǔ)研究為HPV感染性疾病相關(guān)性疫苗