人乳頭瘤病毒16型E2蛋白誘導宮頸癌Caski細胞凋亡的分子機制的研究.pdf

1、目的：人乳頭瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白是HPV16病毒基因編碼的早期蛋白，是誘導HPV16感染的宮頸癌細胞發(fā)生細胞凋亡的重要分子。然而，目前研究對于E2蛋白誘導宮頸癌細胞凋亡有關的具體片段知之甚少。本課題將分析鑒定HPV16 E2蛋白與誘導宿主細胞凋亡有關片段并分析其誘導宮頸癌細胞凋亡的分子機制，為宮頸癌的免疫治療尋找新的分子靶點。
　　方法：（1）將目的基因HPV16E2、HPV16NE2和HPV16HCE2構建到真核表

2、達載體pEF1-Myc-6His-C上；（2）運用脂質體轉染技術將重組質粒pEF1-E2-Myc-6His、pEF1-NE2-Myc-6His和pEF1-HCE2-Myc-6His及空載質粒pEF1-Myc-6His-C分別瞬時轉染至宮頸癌細胞系Caski細胞中，并通過Western Blotting方法檢測各目的基因在Caski細胞中的表達情況；（3）用MTT法檢測分別瞬時轉染pEF1-E2組、pEF1-NE2組和pEF1-HCE2組

3、與陰性對照組（即空載組pEF1-C）相比較Caski細胞的細胞增殖情況；（4）用Western Blotting檢測各組Caski細胞中凋亡相關蛋白Cleaved-PAPR的表達情況；并用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒與流式細胞儀檢測各組Caski細胞凋亡情況。
　　結果：(1)成功構建真核表達重組質粒pEF1-E2-Myc-6His、pEF1-NE2-Myc-6His和pEF1-HCE2-Myc-6His；（

4、2）帶有Myc標簽的HPV16E2、HPV16NE2及HPV6HCE2融合蛋白在宮頸癌細胞系Caski細胞中成功表達；(3) MTT法檢測Caski細胞的增殖情況顯示：與陰性對照組（空載組pEF1-C）相比較，瞬時轉染pEF1-NE2組和pEF1-HCE2組的Caski細胞的細胞增殖情況在培養(yǎng)24h、48h、72h和96h均無明顯統(tǒng)計學差異（p>0.05）；瞬時轉染pEF1-E2組在培養(yǎng)24h細胞增殖無明顯統(tǒng)計學差異（p>0.05),而

5、在培養(yǎng)48h細胞增殖較陰性對照組細胞受抑制（p=0.028<0.05），72h和96h細胞增殖明顯受抑制（p<0.01）；（4）Western Blotting結果顯示pEF1-E2組細胞凋亡相關蛋白Cleaved-PARP的表達量較高，而pEF1-NE2組和pEF1-HCE2組中細胞凋亡相關蛋白Cleaved-PARP則無明顯表達；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測結果顯示，與空白對照組及陰性對照組相比較，pEF1