人乳頭狀瘤病毒16癌蛋白誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌血管生成信號(hào)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、[目的]
　　 探討在非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)細(xì)胞中，高危型人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16 E6和E7癌蛋白激活的信號(hào)通路對(duì)低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia-inducible Factor-1α，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和IL-8(Inte

2、rleukins-8，IL-8)蛋白表達(dá)以及體外血管生成的影響，并進(jìn)一步闡明E6或E7癌蛋白誘導(dǎo)HIF-1α蛋白過(guò)表達(dá)的機(jī)制。
　　 [方法]
　　 1.穩(wěn)定表達(dá)HPV16 E6或E7蛋白細(xì)胞系的建立:用脂質(zhì)體將EGFP質(zhì)?？蛰d體和攜帶有HPV16 E6和E7及其突變體基因的質(zhì)粒(E6、 E7、 E6m和E7m)分別轉(zhuǎn)入A549和NCI-H460細(xì)胞。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，G418結(jié)合流式細(xì)胞儀分選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。用PCR擴(kuò)增細(xì)胞

3、目的基因，用Western blotting檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。
　　 2.HIF-1α蛋白過(guò)表達(dá)模型驗(yàn)證:Western blotting檢測(cè)各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平。
　　 3.E6和E7癌蛋白對(duì)體內(nèi)血管生成影響的驗(yàn)證:用基質(zhì)膠在裸鼠皮下建立體內(nèi)血管生成模型，10天后觀察血管生成情況，并用于免疫組化測(cè)定基質(zhì)膠中VEGF、 HIF-1α和CD31蛋白的表達(dá)水平。
　　 4.E6和E7癌蛋白對(duì)

4、VEGF基因啟動(dòng)子活性的影響:用雙熒光素酶法檢測(cè)各組細(xì)胞螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的熒光強(qiáng)度，計(jì)算并比較各組細(xì)胞中VEGF基因啟動(dòng)子活性。
　　 5.E6和E7癌蛋白對(duì)PI3K/Akt、ERK1/2和JNK/c-Jun信號(hào)通路的影響:用基因芯片檢測(cè)E6或E7癌蛋白對(duì)NSCLC細(xì)胞中磷酸化蛋白的影響。用Westernblotting驗(yàn)證PI3K/Akt、ERK1/2和JNK/c-Jun信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　

5、 6.PI3K/Akt、ERK1/2和JNK/c-Jun信號(hào)通路對(duì)HIF-1α、VEGF和IL-8蛋白表達(dá)及微管形成的影響:用抑制劑分別抑制p-Akt、p-ERK1/2和p-c-Jun蛋白表達(dá)，Western blotting分析p-Akt、p-ERK1/2和p-c-Jun蛋白抑制后HIF-1α蛋白表達(dá)情況;ELISA分析條件培養(yǎng)液中VEGF和IL-8蛋白表達(dá)情況，實(shí)時(shí)定量PCR分析各組細(xì)胞中VEGF和IL-8 mRNA表達(dá)情況;體外血

6、管生成試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)微管形成的影響。
　　 7.E6和E7癌蛋白對(duì)HIF-1α蛋白穩(wěn)定性和泛素化水平的影響:用放線菌酮(cycloheximide，CHX)和MG132分別抑制各組細(xì)胞（穩(wěn)定表達(dá)HPV16 E6或E7、突變體、空載體的肺癌細(xì)胞）中HIF-1α蛋白的合成和降解，采用Western blotting分析HIF-1α蛋白表達(dá)水平和泛素化水平。
　　 8.c-Jun蛋白對(duì)HIF-1α、VEGF和I

7、L-8蛋白表達(dá)和微管形成的影響:用si-RNA沉默c-Jun基因，Western blotting分析c-Jun蛋白被抑制后HIF-1α蛋白的表達(dá)水平、HIF-1α穩(wěn)定性和泛素化水平。ELISA分析條件培養(yǎng)液中VEGF和IL-8的表達(dá)水平，用體外血管生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)微管形成情況。
　　 9.E6和E7癌蛋白對(duì)c-Jun和HIF-1α蛋白相互作用的影響:免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中c-Jun和HIF-1α蛋白二聚體含量，并用免疫熒光技

8、術(shù)定位c-Jun和HIF-1α在細(xì)胞中的相互作用位置。
　　 [結(jié)果]
　　 1.PCR及Western blotting結(jié)果顯示，分別成功建立E6、E7癌蛋白穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，且穩(wěn)定表達(dá)E6、E7癌蛋白的細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組;體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)表明E6和E7癌蛋白能明顯促進(jìn)血管形成和Matrigel組織中HIF-1α、VEGF和CD31蛋白的表達(dá);雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)E6癌蛋白的細(xì)胞中VE

9、GF啟動(dòng)子的活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），但E7癌蛋白促進(jìn)VEGF啟動(dòng)子活性的作用不明顯。
　　 2.蛋白質(zhì)芯片結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)E6癌蛋白的細(xì)胞中有16種蛋白磷酸化水平改變，在穩(wěn)定表達(dá)E7的細(xì)胞中有20種蛋白磷酸化水平改變。Western blotting驗(yàn)證結(jié)果表明:E6和E7癌蛋白明顯激活PI3K/Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)通路，但對(duì)ERK1/2信號(hào)通路的影響不明顯;E7癌蛋白明顯激活JNK/c-Jun信號(hào)通路

10、，但E6癌蛋白對(duì)JNK/c-Jun信號(hào)通路影響不明顯。
　　 3.Western blotting結(jié)果顯示:E6和E7癌蛋白促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)具有PI3K/Akt依賴(lài)性;在A549細(xì)胞中E6癌蛋白促進(jìn)HIF-1α蛋白的表達(dá)具有ERK1/2依賴(lài)性，E7癌蛋白促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)不依賴(lài)于ERK1/2信號(hào)通路;在NCI-H460細(xì)胞中E6和E7癌蛋白促進(jìn)HIF-1α蛋白的表達(dá)均不受ERK1/2信號(hào)通路調(diào)控;ELISA和實(shí)時(shí)定量P

11、CR檢測(cè)VEGF和IL-8的表達(dá)水平得到與HIF-1α一致的結(jié)果。體外血管形成實(shí)驗(yàn)也得到與HIF-1α一致的結(jié)果。
　　 4.E6和E7癌蛋白能增強(qiáng)HIF-1α的穩(wěn)定性，降低其泛素化水平，但對(duì)VHL蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯影響。HIF-1α蛋白的表達(dá)依賴(lài)于c-Jun蛋白表達(dá)而不依賴(lài)于p-c-Jun; c-Jun蛋白被抑制后HIF-1α穩(wěn)定性下降，泛素化水平升高。同樣VEGF和IL-8蛋白表達(dá)水平及微管形成能力均下降。免疫共沉淀結(jié)果顯示E

12、6和E7癌蛋白能促進(jìn)HIF-1α-c-Jun蛋白二聚體的形成。免疫熒光結(jié)果顯示HIF-1α-c-Jun二聚體在在細(xì)胞核中形成。
　　 [結(jié)論]
　　 穩(wěn)定表達(dá)的E6和E7癌蛋白能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌血管生成，且E6和E7癌蛋白促進(jìn)HIF-1α、VEGF和IL-8蛋白過(guò)表達(dá)主要受PI3 K/Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)通路調(diào)控。另外，E6和E7癌蛋白可以通過(guò)增強(qiáng)c-Jun與HIF-1α的相互作用，增強(qiáng)HIF-1α的穩(wěn)定性