人乳頭狀瘤病毒16癌蛋白誘導非小細胞肺癌血管生成信號調(diào)控機制的研究.pdf

1、[目的]
　　 探討在非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)細胞中，高危型人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16 E6和E7癌蛋白激活的信號通路對低氧誘導因子-1α（Hypoxia-inducible Factor-1α，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和IL-8(Inte

2、rleukins-8，IL-8)蛋白表達以及體外血管生成的影響，并進一步闡明E6或E7癌蛋白誘導HIF-1α蛋白過表達的機制。
　　 [方法]
　　 1.穩(wěn)定表達HPV16 E6或E7蛋白細胞系的建立:用脂質(zhì)體將EGFP質(zhì)粒空載體和攜帶有HPV16 E6和E7及其突變體基因的質(zhì)粒(E6、 E7、 E6m和E7m)分別轉(zhuǎn)入A549和NCI-H460細胞。瞬時轉(zhuǎn)染后，G418結(jié)合流式細胞儀分選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。用PCR擴增細胞

3、目的基因，用Western blotting檢測目的蛋白表達情況。
　　 2.HIF-1α蛋白過表達模型驗證:Western blotting檢測各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中HIF-1α蛋白表達水平。
　　 3.E6和E7癌蛋白對體內(nèi)血管生成影響的驗證:用基質(zhì)膠在裸鼠皮下建立體內(nèi)血管生成模型，10天后觀察血管生成情況，并用于免疫組化測定基質(zhì)膠中VEGF、 HIF-1α和CD31蛋白的表達水平。
　　 4.E6和E7癌蛋白對

4、VEGF基因啟動子活性的影響:用雙熒光素酶法檢測各組細胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的熒光強度，計算并比較各組細胞中VEGF基因啟動子活性。
　　 5.E6和E7癌蛋白對PI3K/Akt、ERK1/2和JNK/c-Jun信號通路的影響:用基因芯片檢測E6或E7癌蛋白對NSCLC細胞中磷酸化蛋白的影響。用Westernblotting驗證PI3K/Akt、ERK1/2和JNK/c-Jun信號通路中相關(guān)蛋白的表達水平。
　　

5、 6.PI3K/Akt、ERK1/2和JNK/c-Jun信號通路對HIF-1α、VEGF和IL-8蛋白表達及微管形成的影響:用抑制劑分別抑制p-Akt、p-ERK1/2和p-c-Jun蛋白表達，Western blotting分析p-Akt、p-ERK1/2和p-c-Jun蛋白抑制后HIF-1α蛋白表達情況;ELISA分析條件培養(yǎng)液中VEGF和IL-8蛋白表達情況，實時定量PCR分析各組細胞中VEGF和IL-8 mRNA表達情況;體外血

6、管生成試劑盒檢測各組細胞條件培養(yǎng)液對微管形成的影響。
　　 7.E6和E7癌蛋白對HIF-1α蛋白穩(wěn)定性和泛素化水平的影響:用放線菌酮(cycloheximide，CHX)和MG132分別抑制各組細胞（穩(wěn)定表達HPV16 E6或E7、突變體、空載體的肺癌細胞）中HIF-1α蛋白的合成和降解，采用Western blotting分析HIF-1α蛋白表達水平和泛素化水平。
　　 8.c-Jun蛋白對HIF-1α、VEGF和I

7、L-8蛋白表達和微管形成的影響:用si-RNA沉默c-Jun基因，Western blotting分析c-Jun蛋白被抑制后HIF-1α蛋白的表達水平、HIF-1α穩(wěn)定性和泛素化水平。ELISA分析條件培養(yǎng)液中VEGF和IL-8的表達水平，用體外血管生成實驗檢測微管形成情況。
　　 9.E6和E7癌蛋白對c-Jun和HIF-1α蛋白相互作用的影響:免疫共沉淀技術(shù)檢測各組細胞中c-Jun和HIF-1α蛋白二聚體含量，并用免疫熒光技

8、術(shù)定位c-Jun和HIF-1α在細胞中的相互作用位置。
　　 [結(jié)果]
　　 1.PCR及Western blotting結(jié)果顯示，分別成功建立E6、E7癌蛋白穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，且穩(wěn)定表達E6、E7癌蛋白的細胞中HIF-1α蛋白表達水平明顯高于對照組;體內(nèi)血管生成實驗表明E6和E7癌蛋白能明顯促進血管形成和Matrigel組織中HIF-1α、VEGF和CD31蛋白的表達;雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示穩(wěn)定表達E6癌蛋白的細胞中VE

9、GF啟動子的活性顯著高于對照組（P＜0.01），但E7癌蛋白促進VEGF啟動子活性的作用不明顯。
　　 2.蛋白質(zhì)芯片結(jié)果顯示穩(wěn)定表達E6癌蛋白的細胞中有16種蛋白磷酸化水平改變，在穩(wěn)定表達E7的細胞中有20種蛋白磷酸化水平改變。Western blotting驗證結(jié)果表明:E6和E7癌蛋白明顯激活PI3K/Akt/mTOR/P70S6K信號通路，但對ERK1/2信號通路的影響不明顯;E7癌蛋白明顯激活JNK/c-Jun信號通路

10、，但E6癌蛋白對JNK/c-Jun信號通路影響不明顯。
　　 3.Western blotting結(jié)果顯示:E6和E7癌蛋白促進HIF-1α的表達具有PI3K/Akt依賴性;在A549細胞中E6癌蛋白促進HIF-1α蛋白的表達具有ERK1/2依賴性，E7癌蛋白促進HIF-1α的表達不依賴于ERK1/2信號通路;在NCI-H460細胞中E6和E7癌蛋白促進HIF-1α蛋白的表達均不受ERK1/2信號通路調(diào)控;ELISA和實時定量P

11、CR檢測VEGF和IL-8的表達水平得到與HIF-1α一致的結(jié)果。體外血管形成實驗也得到與HIF-1α一致的結(jié)果。
　　 4.E6和E7癌蛋白能增強HIF-1α的穩(wěn)定性，降低其泛素化水平，但對VHL蛋白表達沒有明顯影響。HIF-1α蛋白的表達依賴于c-Jun蛋白表達而不依賴于p-c-Jun; c-Jun蛋白被抑制后HIF-1α穩(wěn)定性下降，泛素化水平升高。同樣VEGF和IL-8蛋白表達水平及微管形成能力均下降。免疫共沉淀結(jié)果顯示E

12、6和E7癌蛋白能促進HIF-1α-c-Jun蛋白二聚體的形成。免疫熒光結(jié)果顯示HIF-1α-c-Jun二聚體在在細胞核中形成。
　　 [結(jié)論]
　　 穩(wěn)定表達的E6和E7癌蛋白能促進非小細胞肺癌血管生成，且E6和E7癌蛋白促進HIF-1α、VEGF和IL-8蛋白過表達主要受PI3 K/Akt/mTOR/P70S6K信號通路調(diào)控。另外，E6和E7癌蛋白可以通過增強c-Jun與HIF-1α的相互作用，增強HIF-1α的穩(wěn)定性