人乳頭瘤病毒16癌蛋白對(duì)肺癌體內(nèi)外血管生成影響的研究.pdf

1、[目的]
　　 人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系甚為密切，其癌蛋白可通過(guò)影響血管生成促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展。然而HPV感染與肺癌發(fā)展的關(guān)系目前還不完全清楚。肺癌是典型的血管依賴性病變，與其他實(shí)體瘤相比血管更豐富，更易發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移；且肺癌組織中的內(nèi)皮增殖是正常組織的30倍～40倍，更易啟動(dòng)肺癌的血管生成。因此，本文擬通過(guò)體內(nèi)外血管生成模型的建立探討HPV-16癌蛋白(E6和E7)對(duì)

2、肺癌血管生成的影響，以尋找HPV感染相關(guān)肺癌防治的潛在分子靶點(diǎn)。
　　 [方法]
　　 本文采用HPV通用引物(MY09和MY11)對(duì)肺癌細(xì)胞系(NCI-H446、NCI-H460、A549和NCI-H1299)進(jìn)行HPV感染情況分析。在pEGFP-N1空載體上分別插入HPV-16 E6和HPV-16 E7癌基因及其突變型基因構(gòu)建pEGFP-N1-HPV-16 E6、E6mutant、E7、E7mutant(分別簡(jiǎn)稱16

3、 E6、16 E6mut、16 E7、16 E7mut)四種重組質(zhì)粒。HPV-16陰性的肺癌細(xì)胞系(A549和NCI-H460)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染含16 E6或16 E7的質(zhì)粒，以轉(zhuǎn)染空載體(empty vector)、含16 E6mut或16 E7mut的質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，僅加轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞用作模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照(簡(jiǎn)稱為Con)。轉(zhuǎn)染后20 h，采用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible f

4、actor，HIF)-1α蛋白表達(dá)的變化、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)細(xì)胞條件培養(yǎng)液中的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)濃度、real-timeRT-PCR測(cè)定HIF-1α和VEGF mRNA水平，并且通過(guò)體外血管生成模型分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)體外血管生成的影響。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的A549細(xì)胞通

5、過(guò)與基質(zhì)膠混合，皮下注射裸鼠構(gòu)建體內(nèi)模型，10天后取出基質(zhì)膠拍照并檢測(cè)血紅蛋白含量，同時(shí)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)法測(cè)定HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)，進(jìn)而分析HPV-16癌蛋白對(duì)體內(nèi)血管生成的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 PCR分析顯示肺癌細(xì)胞系(NCI-H446、NCI-H460、A549和NCI-H1299)在450bp(HPV通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度)處未見擴(kuò)增條帶，而陽(yáng)性對(duì)照

6、組(已知的HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞CaSki)有明顯條帶。雙酶切、PCR以及測(cè)序結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建pEGFP-N1-HPV-16 E6、E6mut、E7和E7mut四種質(zhì)粒。16 E6和16 E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(陰性對(duì)照組和模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照組)；但16 E6和16 E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的HIF-1αmRNA表達(dá)水平同轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比未見明顯改變。另外，16 E6和16 E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組VEGFmRNA和蛋白

7、表達(dá)水平均明顯高于轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P<0.01)，體外模型中16 E6和16 E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的血管生成明顯增多，結(jié)果分析顯示16 E6和16 E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組血管總長(zhǎng)度明顯大于對(duì)照組(P<0.05)。體內(nèi)模型也顯示16 E6和16 E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組血管生成較對(duì)照組明顯，并且16 E6和16 E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的血紅蛋白含量及HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)較對(duì)照組高，特別是VEGF蛋白表達(dá)的差異更明顯。
　　 [結(jié)論]
　　 HPV-