RNAi沉默人宮頸癌CaSki細(xì)胞HPV-16 E6基因表達(dá)的研究.pdf

1、子宮頸癌(cervicalcancer,CC)是危害廣大婦女健康最常見的惡性腫瘤之一，研究表明，人乳頭瘤病毒(humanpapillomavimses,HPV)的E6、E7癌基因在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。E6癌基因編碼合成的E6蛋白可以與細(xì)胞內(nèi)野生型抑癌基因產(chǎn)物P53蛋白相結(jié)合，在E6相關(guān)蛋白的作用下使P53經(jīng)泛素介導(dǎo)的途徑降解，從而使P53抑制細(xì)胞生長及促進(jìn)凋亡的作用喪失，使細(xì)胞中DNA損傷累積，從而誘導(dǎo)宮頸組織癌變；E7

2、與pRb相結(jié)合使其磷酸化并釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子,E2F激活基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄由G1期進(jìn)入S期所需的基因，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失控，從而使細(xì)胞發(fā)生永生化。因此，E6基因是宮頸癌基因治療的理想靶基因之一。 RNA干擾是近年來發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的方式，是生物進(jìn)化中的一種保守行為，具有抵抗病毒入侵和維持基因組穩(wěn)定性等作用。由于RNAi能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中敲低多種基因的表達(dá)，為腫瘤的基因治療開辟了一條新的途徑。研究表明，利用RNAi技術(shù)特

3、異地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過度表達(dá)，使這些基因保持沉默狀態(tài)，有望達(dá)到抗腫瘤的效果。本課題采用RNA干擾技術(shù)，以HPV-16的E6基因?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)，探討抑制人宮頸癌CaSki細(xì)胞中HPV-16E6基因表達(dá)對(duì)于宮頸癌CaSki細(xì)胞的生長抑制作用以及對(duì)于裸鼠移植瘤成瘤的影響，并用表達(dá)HPV-16E6的小干擾RNA對(duì)人宮頸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤進(jìn)行基因治療，觀察其對(duì)腫瘤生長的影響及其病理變化。為宮頸癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本研究

4、主要分為以下三個(gè)部分： 1．RNA干擾抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞中E6基因的表達(dá)。方法：獲取HPV-16E6基因的序列，結(jié)合生物信息學(xué)工具設(shè)計(jì)并選擇HPV-16E6基因特異性的小干擾RNA(smallinterfereceRNA，siRNA)，把它克隆到表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorenceprotein,EGFP)的真核表達(dá)質(zhì)粒上；體外轉(zhuǎn)染到宮頸癌Caski細(xì)胞株中，觀察熒光的表達(dá)，鑒定轉(zhuǎn)染效率；用R

5、T-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后E6mRNA的表達(dá)，用westernblot檢測(cè)P53蛋白的表達(dá)，以檢測(cè)E6siRNA對(duì)于E6基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的抑制效果。結(jié)果：成功的構(gòu)建了兩條表達(dá)HPV-16E6siRNA(pGensil-CH1和pGensil-CH2)的重組質(zhì)粒和一條陰性對(duì)照重組質(zhì)粒pGensil-HK，經(jīng)酶切鑒定和DNA測(cè)序分析表明，siRNA片段均插入正確。將這些重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到CaSki中，48小時(shí)后觀察熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染

6、效率均達(dá)到50％以上。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，轉(zhuǎn)染pGensil-CHl和pGensil-CH2的CaSki細(xì)胞中E6mRNA表達(dá)水平降低，與對(duì)照組相比，結(jié)果均具有顯著性差異，E6mRNA的抑制率分別為58．2％和62．7％；轉(zhuǎn)染pGensil-CH1和pGensil-CH2后CaSki細(xì)胞中P53蛋白水平升高，與對(duì)照組相比，結(jié)果具有顯著性的差異。結(jié)論：表明所構(gòu)建的E6siRNA表達(dá)質(zhì)粒能有效地抑制CaSki細(xì)胞中HPV-16E6基因的表達(dá)。

7、 2．E6基因的抑制對(duì)CaSki細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法：大量制備無內(nèi)毒素的重組表達(dá)質(zhì)粒，與脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染到宮頸癌細(xì)胞株CaSki細(xì)胞中；光鏡下直接觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，熒光顯微鏡觀察不同轉(zhuǎn)染時(shí)間熒光的表達(dá)；AnnexinⅤ法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化進(jìn)一步驗(yàn)證凋亡結(jié)果；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化；MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長增殖；細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用。結(jié)果：細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染一周后，CH

8、l組、CH2組、HK組的細(xì)胞存活率分別為38．3％、30．9％和93％；MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染表達(dá)E6siRNA的重組質(zhì)粒pGensil-CH1和pGensil-CH2后能明顯抑制CaSki細(xì)胞的增殖，CaSki細(xì)胞增殖的抑制率分別為51．5％和57．1％，轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pGensil-HK的細(xì)胞抑制率為8．5％；結(jié)果有明顯的差異(P<0．01)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，少量細(xì)胞發(fā)生懸浮，少量貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落等形態(tài)學(xué)變

9、化。AnnecxinⅤ檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pGensil-CHl組和pGensil-CH2組細(xì)胞的凋亡率分別是凋亡率為12．84％、和17．83％，與對(duì)照組(4．87％)相比，差異具有顯著性(P＜0．05)。電鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，可見到轉(zhuǎn)染了pGensil-CHl和pGensil-CH2的CaSki細(xì)胞中有大量的脂褐素沉積，胞漿中有空泡出現(xiàn)，可以看到有凋亡小體的發(fā)生。流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)沉默E6后，G0-G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，與對(duì)照

10、相比，結(jié)果具有顯著性。結(jié)論：CaSki細(xì)胞中HPV-16E6基因的沉默抑制細(xì)胞的生長，使細(xì)胞周期出現(xiàn)G2／M阻滯；并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 3．沉默HPV-16E6基因?qū)θ藢m頸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用。方法：將HPV-16E6特異性的siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到人宮頸癌細(xì)胞株CaSki細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選，得到HPV16E6表達(dá)降低的細(xì)胞CaSki-CH2及CaSki-HK細(xì)胞，將這些細(xì)胞接種到BALB／c裸鼠背部皮下，并以CaS

11、ki細(xì)胞接種為對(duì)照，觀察細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤情況，定期腫瘤的體積大小變化，處死裸鼠，稱瘤重，計(jì)算腫瘤抑制率；同時(shí)取接種人宮頸癌CaSki細(xì)胞移植瘤的裸鼠，待腫瘤直徑大于O．5時(shí)注射重組質(zhì)粒，觀察腫瘤體積變化；處死小鼠，稱瘤重，觀察腫瘤組織的病理改變，電鏡檢測(cè)腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：成功篩選到持續(xù)表達(dá)E6siRNA的CaSki細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)該細(xì)胞中HPV-16E6基因表達(dá)降低；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處理后的CaSki細(xì)胞成瘤能

12、力明顯降低，抑瘤率為71．4％；注射質(zhì)粒進(jìn)行基因治療后，裸鼠腫瘤生長受到抑制，腫瘤的體積與重量明顯低于對(duì)照組，差異具有顯著性。病理檢查發(fā)現(xiàn)，處理組腫瘤生長不佳，細(xì)胞分裂相少見，組織內(nèi)有較多壞死區(qū)域。電鏡下可以看到，經(jīng)pGensil-CH2處理后的CaSki細(xì)胞中可觀察到壞死細(xì)胞和凋亡小體。結(jié)論：沉默CaSki細(xì)胞中HPV-16E6基因的表達(dá)能明顯降低宮癌細(xì)胞的致瘤作用；表達(dá)HPV-16E6siRNA的重組質(zhì)粒能抑制裸鼠宮頸癌細(xì)胞移植瘤的