宮頸癌組織HPV16早期基因E6-E7相關(guān)轉(zhuǎn)錄本以及整合基因的分析.pdf

1、目的:
　　宮頸癌的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，而high-risk human papillomavirus(HR-HPV)早期基因E6/E7的持續(xù)表達(dá)是引起宮頸癌的最主要原因之一。其中HPV16是最常見的高危型別，因此建立宮頸癌組織HPV16早期基因E6/E7相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的檢測方法，系統(tǒng)分析宮頸癌發(fā)生各時(shí)期HPV16早期基因E6和E7的相關(guān)轉(zhuǎn)錄模式以及整合基因和整合位點(diǎn)鄰近的基因，并探討其致癌作用。
　　方法:
　　1、收

2、集63例HPV16陽性的宮頸腫瘤組織，包括8例低度上皮內(nèi)瘤變(LSIL)組織樣本、38例高度上皮內(nèi)瘤變(HSIL)組織樣本和17例宮頸癌組織樣本，同時(shí)以HPV16陽性的人宮頸癌細(xì)胞Caski作為陽性對照，以正常宮頸組織作為陰性對照，用TRIzol法抽提并提純（去DNA處理）全RNA;
　　2、利用含保守序列的RT引物將標(biāo)本中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成5'端含保守序列的cDNA，接著用HPV16 E6特異性引物(P6)、HPV16 E7特異

3、性引物(P7)和保守序列引物(P0)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立特異性擴(kuò)增HPV16 E6和E7相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的方法;
　　3、設(shè)計(jì)HPV16 E6和E7特異性探針，采用Southern Blotting的方法驗(yàn)證相關(guān)轉(zhuǎn)錄片段;
　　4、切膠回收PCR擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄片段，并連接載體測序。通過BLAST比對分析宮頸癌組織HPV16早期基因E6、E7相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的序列和整合的宿主序列，并繪制轉(zhuǎn)錄模式圖。
　　結(jié)果:
　　1、本研究

4、利用人乳頭瘤病毒癌基因轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增的方法，用兩對引物HPV16 E6特異性引物(P6)、HPV16 E7特異性引物(P7)和保守序列(P0)分別對宮頸癌組織、正常宮頸組織（陰性對照）和HPV16陽性的宮頸癌細(xì)胞Caski（陽性對照）的cDNA以及宮頸癌組織的RNA（陰性對照）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，宮頸癌組織和Caski細(xì)胞有擴(kuò)增片段，正常組織和RNA都未見擴(kuò)增片段。表明，HPV16早期基因E6和E7相關(guān)轉(zhuǎn)錄本特異性擴(kuò)增的方法建立成功。
　

5、　2、分析HPV16陽性的LSIL、HSIL及宮頸癌組織中E6轉(zhuǎn)錄片段發(fā)現(xiàn)在LSIL樣本中，只有少量的E6轉(zhuǎn)錄本，常見的片段長度為250bp、500bp和1000bp，在HSIL樣本中，轉(zhuǎn)錄片段數(shù)量和種類明顯多于LSIL，主要的片段長度集中在250bp、650bp和1000bp以上的大片段，而在宮頸癌組織中，除轉(zhuǎn)錄片段的數(shù)量和種類增多以外，優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄片段更加明顯，主要集中在500bp和1000bp。E7基因的轉(zhuǎn)錄本情況與E6類似，LSIL

6、組織中樣本之間轉(zhuǎn)錄本數(shù)差異較大，沒有特征性優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄，而特征性轉(zhuǎn)錄在HSIL和宮頸癌組織中卻比較明顯，尤其是宮頸癌。常見的轉(zhuǎn)錄片段主要有400bp、500bp、750bp、1000bp和1050bp，這說明隨著LSIL向?qū)m頸癌發(fā)展優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄模式逐漸清晰。
　　3、Southern Blotting進(jìn)一步驗(yàn)證E6和E7轉(zhuǎn)錄片段，結(jié)果與電泳一致，并證實(shí)了HPV16 E6和E7轉(zhuǎn)錄模式在宮頸癌發(fā)生發(fā)展不同階段中的變化。
　　4、經(jīng)BL

7、AST比對后共繪制六種HPV16 E6轉(zhuǎn)錄本，模式A、B、C、D和E中未見宿主基因片段，屬于游離型轉(zhuǎn)錄模式，模式F含宿主基因片段，屬于整合型轉(zhuǎn)錄模式。模式A中E6基因的3'端有兩種斷裂位點(diǎn)，分別是nt442和nt468;模式A和模式B都只有E6一種序列;模式C和D的區(qū)別在于E5基因3'端結(jié)尾的堿基位點(diǎn)，分別是nt4150和nt4233。在這六種轉(zhuǎn)錄模式中，除模式F以外，其他的均為首次發(fā)現(xiàn)。
　　5、經(jīng)BLAST比對后共繪制五種HP

8、V16 E7轉(zhuǎn)錄本。模式A和模式E屬于游離型轉(zhuǎn)錄本，模式B、C和D屬于整合型。模式A中E1基因的3'端有四種斷裂位點(diǎn)，分別在nt880、nt949、nt1054和nt1234;模式B中E1基因的3'端有兩種剪切位點(diǎn)，分別在nt880和nt1107。在這些轉(zhuǎn)錄模式中，除已經(jīng)有報(bào)道的模式B和D以外，其他三種模式A、C和E是首次發(fā)現(xiàn)。
　　6、HPV16早期基因E6和E7的轉(zhuǎn)錄模式在不同癌變程度的宮頸組織中存在較大差異。
　　7、

9、將全部轉(zhuǎn)錄模式中的宿主基因序列做BLASTn比對，發(fā)現(xiàn)除了21號(hào)染色體和X染色體以外，其他人類染色體都有發(fā)生整合。同一樣本多條染色體整合的樣本占27.5％，同一染色體多個(gè)位點(diǎn)整合的樣本占35％，并且發(fā)生多重整合的比例在宮頸癌中遠(yuǎn)高于LSIL和HSIL組織。有關(guān)基因整合的脆性位點(diǎn)共發(fā)現(xiàn)22個(gè)，其中FRA13A發(fā)生整合的頻率最高。統(tǒng)計(jì)各個(gè)整合基因的頻率發(fā)現(xiàn)，基因AMICA1、DAPK1、EBAG9和PIBF1整合兩次，基因MRPS31整合四