RNAi干擾HPV16 E6基因?qū)m頸癌Siha細(xì)胞的影響.pdf

1、子宮頸癌是威脅婦女健康的第二大惡性腫瘤。近年來發(fā)病率不斷上升,尤其是在發(fā)展中國(guó)家。每年大約有46萬新發(fā)病例,大約27.4萬患者死于子宮頸癌,且發(fā)病有年輕化趨勢(shì)。子宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)由癌前病變逐漸衍變?yōu)榘┑拈L(zhǎng)期、連續(xù)的病理過程,目前流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)均顯示HPV感染是子宮頸癌的主要致病因素,尤其是高危型HPV感染與子宮頸癌高度相關(guān)。HPV16型是高危型人類乳頭瘤病毒中最常見的類型之一,其早期蛋白E6及E7在宮頸鱗狀上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及

2、惡性表型維持中均扮演著非常重要的角色。E6蛋白可與細(xì)胞內(nèi)的E6相關(guān)蛋白(E6AP)形成E6/E6AP復(fù)合體,并與P53蛋白結(jié)合,E6AP將活化的泛素連接到P53蛋白,通過泛素介導(dǎo)的泛素途徑使P53蛋白降解；E7與生長(zhǎng)抑制蛋白pRB結(jié)合,使pRB蛋白磷酸化,釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F,使感染細(xì)胞得以實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄、增殖。抑癌基因P53、pRB的下調(diào),可激活端粒酶,阻斷干擾素的產(chǎn)生,增加外源DNA的整合及突變,抵抗細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致癌變。RNA干擾(

3、RNA interference,RANi)技術(shù)是近年來新發(fā)展的一項(xiàng)以一個(gè)特異的mRNA降解為目標(biāo)的基因沉默技術(shù),RNAi不僅具有更高的基因特異性,而且抑制效率及抑制穩(wěn)定性均比核酶或反義核酸要高。我們采用RNAi技術(shù)沉默宮頸癌Siha細(xì)胞株中HPV16 E6基因的表達(dá),以觀察HPV16 E6沉默后對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞的生長(zhǎng)及細(xì)胞凋亡的影響,為探索高危型人類乳頭瘤病毒導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的機(jī)制研究提供新的理論依據(jù),以期為宮頸癌的基因治療尋找新的

4、思路。
　　 目的:
　　 利用RNA干擾(RNAi)技術(shù),使用基因特異性的靶向于HPV16 E6基因的小干擾RNA(SiRNA)作用于HPV16 E6陽性的宮頸癌細(xì)胞株SiHa,沉默宮頸癌Siha細(xì)胞的HPV16 E6基因,通過檢測(cè)干擾組與未干擾組之間HPV16 E6 mRNA及蛋白的變化、抑癌蛋白P53的變化,以及各組之間Siha細(xì)胞凋亡率的改變,探討HPV16 E6 SiRNA對(duì)HPV16陽性SiHa細(xì)胞E6基因的

5、特異性抑制作用,以及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,為探索高危型人類乳頭瘤病毒導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的機(jī)制研究提供新的理論依據(jù),為使用RNAi技術(shù)治療宮頸癌的可行性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 (1)SiRNA序列的構(gòu)建:根據(jù)SiRNA的設(shè)計(jì)原則和GenBank中HPV16 E6cDNA序列,應(yīng)用Ambion公司的在線設(shè)計(jì)軟件,分別在其序列不同位點(diǎn)針對(duì)HPV16 E6設(shè)計(jì)兩對(duì)DNA片段,并分別連接至pSilencerTM 3.1-H1

6、hygro,構(gòu)建兩對(duì)小干擾RNA:SiRNA-109(S Ⅰ)及SiRNA-142(S Ⅱ),以及通用陰性對(duì)照NC(NegativeControl)和陽性對(duì)照SiRNA:GAPDH(Human GAPDH)SiRNA,均帶熒光標(biāo)記綠色熒光蛋白(FAM)。測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建的兩對(duì)SiRNA序列與設(shè)計(jì)的DNA序列完全一致。由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。
　　 (2)細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:SiHa細(xì)胞用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng),

7、培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2。于轉(zhuǎn)染前24d'時(shí)鋪至6孔板,培養(yǎng)至細(xì)胞30-50％融合時(shí)使用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分5個(gè)組:空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)、脂質(zhì)體組(LIPO對(duì)照組)、陰性對(duì)照SiRNA轉(zhuǎn)染組(NC轉(zhuǎn)染組)、SiRNA-109轉(zhuǎn)染組(SⅠ轉(zhuǎn)染組)、SiRNA-142轉(zhuǎn)染組(S Ⅱ轉(zhuǎn)染組)。以脂質(zhì)體6μl:SiRNA100pmol比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染,按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作,于OPTI MEMI中培養(yǎng)6小

8、時(shí)后換完全培養(yǎng)基。
　　 (3)RT-PCR檢測(cè)HPV16 E6基因表達(dá):以GAPDH做為內(nèi)參,由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司合成引物,參照TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 3min,94℃ 30s,58℃ 45s,72℃ 45s,32個(gè)循環(huán),72℃1min。取反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,觀察目的條帶、攝片并應(yīng)用灰度分析軟件分析。
　　 (4)Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá):于轉(zhuǎn)

9、染后48h收獲各組細(xì)胞各約1×106個(gè),蛋白裂解液裂解蛋白,變性,10％SDS-PAGE電泳,濕法轉(zhuǎn)印PVDF膜,TBST漂洗后,5％脫脂奶粉封閉,分別與P53、HPV16 E6及GAPDH一抗、二抗孵育,ECL顯色,應(yīng)用灰度分析軟件分析。
　　 (5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:于轉(zhuǎn)染后48 h,各組細(xì)胞分別消化、離心收集。PBS洗滌細(xì)胞后,加入annexin V孵育30min,加PI至終濃度為50mg/L,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

10、r>　　 (6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用one-way ANOVA方差分析,組間多重比較采用LSD法分析,以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 (1)轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞內(nèi)HPV16 E6 mRNA的表達(dá)變化:RT-PCR結(jié)果顯示,未轉(zhuǎn)染組、LIPO對(duì)照組、NC轉(zhuǎn)染組、S Ⅰ轉(zhuǎn)染組及S Ⅱ轉(zhuǎn)染組HPV16 E6mRNA

11、表達(dá)水平分別為0.711±0.023、0.729±0.071、0.741±0.042、0.109±0.028及0.126±0.007,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=202.864,P=0.000)。轉(zhuǎn)染后24h,SⅠ及S Ⅱ轉(zhuǎn)染組Siha細(xì)胞內(nèi)HPV16 E6 mRNA表達(dá)水平比未轉(zhuǎn)染組分別減少了84.7％和82.3％,減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P=0.000,P=0.000)。
　　 (2)轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞HPV16 E6及P5

12、3蛋白表達(dá)水平的變化:Western Blot結(jié)果顯示,未轉(zhuǎn)染組、LIPO對(duì)照組、NC轉(zhuǎn)染組、S Ⅰ轉(zhuǎn)染組及S Ⅱ轉(zhuǎn)染組HPV16 E6蛋白表達(dá)水平分別為1.734±0.013、1.587±0.122、1.753±0.077、0.668±0.074及0.646±0.018,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=182.275,P=0.000)；未轉(zhuǎn)染組、LIPO對(duì)照組、NC轉(zhuǎn)染組、S Ⅰ轉(zhuǎn)染組及S Ⅱ轉(zhuǎn)染組P53蛋白表達(dá)表達(dá)水平分別為0.428±

13、0.030、0.524±0.034、0.4954±0.037、1.477±0.112及1.5964±0.082,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=223.037,P=0.000)。同樣,Western blot檢測(cè)結(jié)果亦顯示,S Ⅰ轉(zhuǎn)染組及SⅡ轉(zhuǎn)染組HPV16 E6蛋白抑制率分別為61.5％及62.7％,減少均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P=0.000,P=0.000)；S Ⅰ轉(zhuǎn)染組及S Ⅱ轉(zhuǎn)染組P53蛋白表達(dá)水平分別較未轉(zhuǎn)染組升高245％及273％

14、,增加均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P=0.000,P=0.000)。
　　 (3)轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞凋亡的變化:轉(zhuǎn)染后48小時(shí),流式細(xì)胞學(xué)分別檢測(cè)未轉(zhuǎn)染組、LIPO對(duì)照組、NC轉(zhuǎn)染組、S Ⅰ轉(zhuǎn)染組及SⅡ轉(zhuǎn)染組凋亡率。結(jié)果顯示:未轉(zhuǎn)染組凋亡率為6.700±0.243；LIPO對(duì)照組凋亡率為6.273±0.780；NC轉(zhuǎn)染組凋亡率為5.963±1.212；S Ⅰ轉(zhuǎn)染組凋亡率為34.387±3.140；SⅡ轉(zhuǎn)染組凋亡率為11.243±1.8

15、76。各組間細(xì)胞凋亡率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=143.806,P=0.000)。組間比較,S Ⅰ轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比細(xì)胞凋亡率顯著增加,增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；SⅡ轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染組相比細(xì)胞凋亡率顯著增加,增加亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010)；S Ⅰ轉(zhuǎn)染組與S Ⅱ轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 通過利用SiRNA介導(dǎo)的基因干擾的手段可以有效下調(diào)宮頸癌Siha細(xì)胞中HP