HPV16 E6 siRNA對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響.pdf

1、背景與研究目的：RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來(lái)的一門新興的在轉(zhuǎn)錄水平上的基因阻斷技術(shù)，是一種雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平上關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)或使其沉默的過(guò)程。目前，在某些病毒性疾病的治療研究中已取得了一定的進(jìn)展，在基因功能研究和基因治療方面也已顯示了巨大的應(yīng)用前景。本研究旨在利用RNAi技術(shù)，通過(guò)體內(nèi)及體外試驗(yàn)以探討HPV16E6小干擾

2、RNA(smallinterferingRNA，siRNA)能否抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及其作用機(jī)理，以期為宮頸癌的治療提供一個(gè)新的特異性基因治療手段，同時(shí)為RNAi應(yīng)用于臨床奠定理論基礎(chǔ)。 方法：1.化學(xué)合成針對(duì)HPV16E6的小干擾RNA(siRNA)，借脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HPV16陽(yáng)性的宮頸癌CaSki細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、活細(xì)胞率及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；采用吖啶橙染色法、透射電子顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)HPV16E6si

3、RNA對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HPV16E6siRNA轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期的變化。2.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HPV16E6siRNA轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中HPV16E6、p53、p21mRNA及E6、p53、p21、CDK2蛋白表達(dá)的變化。3.建立宮頸癌裸鼠移植瘤模型，將HPV16E6siRNA通過(guò)瘤內(nèi)給藥的方式注入裸鼠體內(nèi)，測(cè)定腫瘤體積、瘤重以了解HPV16E6siRNA對(duì)皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

4、；原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況；采用免疫組化法測(cè)定瘤體內(nèi)HPV16E6、p53蛋白表達(dá)的變化；檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)含量及肝腎臟HE染色觀察，以初步了解E6siRNA對(duì)肝臟有無(wú)毒性作用。 結(jié)果：1.HPV16E6siRNA轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，細(xì)胞活力下降，作用第5天時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高達(dá)77.4％；吖啶橙染色及透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示

5、，轉(zhuǎn)染后48h，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)較多凋亡小體；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染后48h細(xì)胞凋亡率最高，達(dá)40.5％，凋亡指數(shù)39.45％±1.48％，明顯高于空白組(p＜0.05)；細(xì)胞周期分析顯示E6siRNA并未將細(xì)胞阻滯在G1期。2.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，E6siRNA轉(zhuǎn)染24h，細(xì)胞內(nèi)E6mRNA的表達(dá)與空白組相比降低了12.73倍，差異顯著(p＜0.05)。而p53、p21mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化；E6siRNA轉(zhuǎn)染48h，

6、細(xì)胞內(nèi)E6蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，p53、p21蛋白表達(dá)相應(yīng)地升高，CDK2蛋白水平下降。3.建立宮頸癌裸鼠移植瘤模型，瘤內(nèi)注入HPV16E6siRNA后，與對(duì)照組相比，腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，腫瘤體積及瘤重均明顯降低(p＜0.05)；TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)E6siRNA處理的腫瘤組織細(xì)胞凋亡明顯增加；免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，腫瘤組織HPV16E6和p53蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組；兩組裸鼠血清ALT、AST含量無(wú)明顯差異，且試驗(yàn)組肝腎臟HE染色無(wú)明顯異