CDK2-siRNA和Cyclin E-siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞周期影響的研究.pdf

1、目的 應(yīng)用RNlA干擾(RNAi)技術(shù)分別研究重組質(zhì)粒p<'Genesil-1-CDK2>、P<'Genesil-1-Cyclin E>抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2內(nèi)源CDK2、Cyclin E基因的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展的影響，探討CDK2、Cyclin E作為抗腫瘤藥物研發(fā)靶點(diǎn)的可行性。 方法 將重組質(zhì)粒p<'Genesil-1-CDK2>、P<'Genesil-1-Cyclin E>及陰性對(duì)照P<'Genes

2、il-1-HK>轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，72小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并收獲細(xì)胞，應(yīng)用半定量RT-PCR檢測CDK2及Cyelin E mRNlA的含量；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞DNA含量，確定細(xì)胞周期進(jìn)展；轉(zhuǎn)染0h、8h、16h、24h、48h、72h分別細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長曲線；轉(zhuǎn)染后0h、72h倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 結(jié)果 轉(zhuǎn)染72h后，熒光顯微鏡觀察綠色熒光達(dá)到60-70％，表明轉(zhuǎn)染成功；RT-PCR檢測結(jié)果

3、表明與對(duì)照組相比CDK2 mRNA和Cyclin E mRNA拷貝數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組無明顯差異；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示p<'Genesil-1-CDK2>組G1期細(xì)胞比例由61.65±2.00％上升到78.12±1.78％，S期細(xì)胞比例由27.63±3.8％下降到16.07±2.84％(P<0.05)；P<'Genesil-1-Cyclin E>組Gl期細(xì)胞比例由61.65±2.00％上升到78.01±0

4、.38％，S期細(xì)胞比例由27.63±3.8％下降到16.40±1.67％(P<0.05)，說明兩組細(xì)胞均被阻滯到G1期；倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染72h后p<'Genesil-1-CDK2>、P<'Genesil-1-Cyclin E>轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖明顯減少，生長停滯，細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性及空白對(duì)照組；細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示p<'Genesil-1-CDK2>、P<'Genesil-1-Cyclin E>轉(zhuǎn)染組細(xì)胞明顯生長緩慢，細(xì)胞數(shù)