多西紫杉醇和人參皂甙對宮頸癌疫苗HPV16 L2E6E7的佐劑作用.pdf

1、宮頸癌是威脅女性健康的第二大惡性腫瘤。研究表明其發(fā)生與人乳頭狀病毒(Humanpapillomavirus，HPV)感染密切相關(guān)。因此，有可能以通過預(yù)防和治療HPV感染來防治宮頸癌。目前國外已有預(yù)防HPV感染的疫苗問世。HPV16 L2E6E7是我國目前正在研制的一種HPV融合蛋白疫苗（簡稱HPV疫苗），目前正在申報(bào)臨床試驗(yàn)。像其它蛋白疫苗一樣，該融合蛋白疫苗尚存在免疫原性差的缺點(diǎn)。在疫苗中添加佐劑是增強(qiáng)疫苗免疫效果的常用方法。本論文擬

2、研究在HPV疫苗中添加多西紫杉醇和人參皂甙對該疫苗免疫效果的影響，為臨床應(yīng)用提供參考。
　　1、多西紫杉醇對HPV疫苗的免疫佐劑作用
　　目的:探究多西紫杉醇對HPV疫苗抗腫瘤免疫的增強(qiáng)作用。
　　方法:實(shí)驗(yàn)一:在-1天給36只C57BL/6小鼠接種TC-1腫瘤細(xì)胞（104個(gè)/只）后，將小鼠隨機(jī)分成6組:(1)生理鹽水組，(2)疫苗組（120μg HPV），(3)多西紫杉醇（200μg）對照組，(4)多西紫杉醇佐劑1組

3、(120μg HPV+100μg多西紫杉醇)，(5)多西紫杉醇佐劑2組（120μg HPV+200μg多西紫杉醇），(6)多西紫杉醇佐劑3組（120μg HPV+400μg多西紫杉醇）。于第0、3和7天在小鼠后腿肌肉處先后注射免疫三次。在21天收集小鼠瘤塊用于檢測抑瘤率、收集血清用于檢測IgG抗體及其亞類和脾細(xì)胞用于檢測E749-56抗原刺激產(chǎn)生的分泌IFN-γ和IL-10的淋巴細(xì)胞數(shù)、Treg細(xì)胞數(shù)以及CTL細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)二:分組和處

4、理同實(shí)驗(yàn)一。每隔3天測量腫瘤大小并觀察記錄小鼠存活情況。
　　結(jié)果:多西紫杉醇顯著抑制了小鼠體內(nèi)腫瘤的生長，延長了荷瘤小鼠存活時(shí)間，提高了HPV疫苗在荷瘤小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性抗體及其亞類水平和CTL細(xì)胞對TC-1腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，減少了脾細(xì)胞中Treg細(xì)胞的數(shù)量，上調(diào)了分泌E749-56特異性IFN-Υ的淋巴細(xì)胞數(shù)，而對分泌IL-10的淋巴細(xì)胞數(shù)影響較小。
　　2、人參皂甙Rg1對HPV疫苗的免疫佐劑作用
　　目的:

5、探究人參皂甙Rg1對HPV疫苗的免疫增強(qiáng)作用。
　　方法:將64只小鼠隨機(jī)分成8組:(1)生理鹽水組，(2)Rg1（100μg）對照組，(3)疫苗低劑量（10μg HPV）組，(4)疫苗高劑量（100μg HPV）組，(5) Rg1佐劑1組（10μg HPV+25μg Rg1），(6)Rg1佐劑2組（10μg HPV+50μg Rg1），(7)Rg1佐劑3組（10μg HPV+100μg Rg1）組，(8) Rg1佐劑4組(10μ

6、g HPV+200μg Rg1)。于第0、3和7天在小鼠后腿肌肉處先后注射免疫三次。在第21天采集小鼠血清用于檢測IgG及其亞類水平，收集脾細(xì)胞檢測刀豆蛋白(ConA)和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖活性，E749-56抗原刺激產(chǎn)生的IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-4和IL-12 mRNA水平。
　　結(jié)果:Rg1能顯著提高小鼠體內(nèi)抗HPV特異性抗體及其亞類水平，增加分泌E749-56特異性IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)，提高淋

7、巴細(xì)胞對LPS和ConA刺激的刺激指數(shù)以及細(xì)胞因子IL-4和IL-12 mRNA表達(dá)水平。
　　3、人參皂甙Rg3對HPV疫苗的免疫佐劑作用
　　目的:探究人參皂甙Rg3對HPV疫苗的免疫增強(qiáng)作用。
　　方法:將36只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成6組，(1)生理鹽水組，(2) Rg3(50μg)對照組，(3)疫苗組（120μg HPV），(4)Rg3佐劑1組（120μg HPV+25μg Rg3），(5) Rg3佐劑2組

8、(120μg HPV+50μg Rg3)組，(6) Rg3佐劑3組（120μg HPV+100μg Rg3）。于第0、3和7天在小鼠后腿肌肉處先后注射免疫三次。在21天收集血清用于檢測IgG抗體;收集脾細(xì)胞用于檢測分泌E749-56特異性IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)果:Rg3顯著提高了正常小鼠體內(nèi)抗HPV特異性抗體水平和增加分泌E749-56特異性IFN-γ淋巴細(xì)胞數(shù)。
　　4、人參皂甙Rg3和多西紫杉醇配伍不增加對HP

9、V疫苗的佐劑作用
　　目的:探究人參皂甙Rg3和多西紫杉醇配伍對HPV疫苗抗腫瘤免疫的增強(qiáng)作用。
　　方法:實(shí)驗(yàn)一:在-1天將C57BL/6小鼠接種TC-1腫瘤細(xì)胞（104個(gè)/只），然后隨機(jī)分成8組:(1)生理鹽水組，(2) Rg3(100μg)對照組，(3)多西紫杉醇（200μg）對照組，(4)配伍對照組（100μgRg3+200μg多西紫杉醇），(5)疫苗（120μg HPV）組,(6) Rg3佐劑組(120μg HPV

10、+100μgRg3)，(7)多西紫杉醇佐劑組（120μg HPV+200μg多西紫杉醇），(8)配伍佐劑組（120μg HPV+100μg Rg3+200μg多西紫杉醇）。于第0、3和7天在小鼠后腿肌肉處先后注射免疫三次。在21天收集小鼠血清用于檢測IgG抗體及其亞類;收集小鼠脾細(xì)胞用于檢測分泌E749-56特異性IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù);收集小鼠瘤塊用于計(jì)算抑瘤率。實(shí)驗(yàn)二:分組和處理同實(shí)驗(yàn)一，每隔3天測量腫瘤大小并觀察記錄小鼠存活情況。

11、
　　結(jié)果:多西紫杉醇和Rg3配伍與單獨(dú)使用多西紫杉醇作為佐劑相比，在延長荷瘤小鼠的存活時(shí)間、提高特異性抗體水平和增加分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)方面，無顯著差異，說明Rg3不增加多西紫杉醇的佐劑作用。
　　5、多西紫杉醇對細(xì)胞免疫的影響
　　目的:研究多西紫杉醇對細(xì)胞免疫的影響。
　　方法:將20只C57BL/6小鼠分別在0,3，7天進(jìn)行肌肉注射120μg HPV疫苗。在21天收集脾臟、周圍淋巴結(jié)內(nèi)的淋巴細(xì)胞用于

12、檢測T細(xì)胞的殺傷活性和Fas、 FasL、M6PR、Perforin、 GzB以及Caspase-3 mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)與單獨(dú)處理CTL細(xì)胞或者TC-1細(xì)胞相比，多西紫杉醇同時(shí)處理這兩種細(xì)胞后，CTL對TC-1細(xì)胞的殺傷作用最強(qiáng)，且呈濃度依賴關(guān)系;(2)多西紫杉醇能顯著增強(qiáng)TC-1細(xì)胞中Fas、M6PR和Caspase-3基因和T細(xì)胞中FasL和GzB mRNA的表達(dá)水平。
　　6、多西紫杉醇作為HPV疫

13、苗佐劑對腫瘤徼環(huán)境的影響
　　目的:研究多西紫杉醇對腫瘤微環(huán)境的影響。
　　方法:在-1天給40只C57BL/6小鼠接種TC-1腫瘤細(xì)胞（104個(gè)/只）后，將小鼠隨機(jī)分成4組:(1)生理鹽水組，(2)多西紫杉醇(200μg)對照組，(3)疫苗組（120μg HPV），(4)多西紫杉醇佐劑組（120μg HPV+200μg多西紫杉醇）。于第0、3和7天在小鼠后腿肌肉處先后注射免疫三次。在21天收集小鼠瘤塊用于檢測Treg細(xì)胞數(shù)

14、量和IL-10、 IFN-γ、 VEGF以及STAT-3 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:多西紫杉醇降低了瘤塊中Treg細(xì)胞的數(shù)量以及IL-10、 VEGF和STAT-3 mRNA的表達(dá)水平，增加了IFN-γmRNA的表達(dá)水平。
　　綜上所述，多西紫杉醇對HPV疫苗具有顯著佐劑作用，可顯著提高HPV疫苗對荷瘤小鼠的抗腫瘤能力，延長荷瘤小鼠存活時(shí)間;人參皂甙Rg1、 Rg3對HPV疫苗具有佐劑作用，增強(qiáng)HPV疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答