人白介素24基因治療宮頸癌CaSki細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、子宮頸癌(cervical cancer，CC)是危害廣大婦女健康最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)每年新發(fā)病例有13.5萬(wàn)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，年輕婦女中宮頸癌的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢(shì)，發(fā)病以每年2％～3％的速度增長(zhǎng)。宮頸癌越來(lái)越引起人們廣泛的關(guān)注。 近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)宮頸癌發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，尤其是DNA重組技術(shù)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)逐步成熟，研究者們提出了利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)向體內(nèi)導(dǎo)入目的基因，從而對(duì)宮頸癌發(fā)病的分子

2、環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)的防治策略，為宮頸癌的治療開(kāi)辟了新途徑。 本研究擬以人白介素24(HL-24)和HPV E6 siRNA作為分子工具，采用真核表達(dá)載體為基因?qū)牍ぞ邔?duì)人宮頸癌中具有代表性的CaSki細(xì)胞株進(jìn)行基因治療的實(shí)驗(yàn)研究，主要探討外源性hIL-24的表達(dá)對(duì)治療宮頸癌CaSki細(xì)胞所發(fā)揮的作用及其內(nèi)在機(jī)制，以及聯(lián)合RNAi技術(shù)是否具有協(xié)同效應(yīng)。以期為宮頸癌基因治療的進(jìn)一步深入研究奠定必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究方法：

3、1．hIL-24基因的克隆鑒定，構(gòu)建真核表達(dá)載體及表達(dá)鑒定。培養(yǎng)CaSki細(xì)胞，提取其RNA作為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增hIL-24基因全部編碼序列，將其克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上進(jìn)行測(cè)序分析。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的CaSki細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。Western blot鑒定是否成功表達(dá)hIL-24蛋白。 2．hIL-24基因誘導(dǎo)人宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)。①以脂質(zhì)體包裹重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcD

4、NA3.1(+)-hIL-24轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞。②利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)處理后CaSN細(xì)胞中HPV E6癌基因的mRNA水平變化。③Western blot分析處理后CaSki細(xì)胞中抑癌蛋白P53水平的變化。④處理后的CaSki細(xì)胞凋亡檢測(cè)：透射電鏡觀察，流式細(xì)胞儀分析，TUNEL實(shí)驗(yàn)，hochest 33342熒光染色。 3．細(xì)胞體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)。①采用細(xì)胞體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pcDNA3.1(+)-hIL-24處理后

5、CaSki細(xì)胞遷移、侵襲能力的改變。②Western blot檢測(cè)與細(xì)胞遷移、侵襲能力有關(guān)的 E-cadherin，MMP-2和p38 MAPK蛋白水平。 4．HPV-16 E6 siRNA 與hIL-24基因聯(lián)合誘導(dǎo)人宮頸癌CaSki細(xì)胞的凋亡。①攜帶HPV-16 E6 siRNA與hIK-24基因的質(zhì)粒載體分別以單獨(dú)或聯(lián)合的方式轉(zhuǎn)染人宮頸癌CaSki細(xì)胞，處理后利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中HPV E6癌基因的mRNA水平變

6、化。②Western blot分析細(xì)胞中抑癌蛋白P53水平的變化。③流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。 5．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。①篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-hIL-24質(zhì)粒的CaSki細(xì)胞株，注射裸鼠，觀察細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤情況，定期測(cè)量腫瘤的體積大小，處死裸鼠，稱(chēng)瘤重，計(jì)算腫瘤抑制率。②建立荷瘤裸鼠模型，于瘤體內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的pcDNA3.1(+)-hIL-24質(zhì)粒，定期測(cè)量腫瘤的體積大小，處死裸鼠，稱(chēng)瘤重，計(jì)算腫瘤抑制率。觀察

7、腫瘤組織的病理改變。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．①分別以人宮頸癌CaSki和Hela細(xì)胞總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)只有CaSki細(xì)胞擴(kuò)增出一條特異性條帶，長(zhǎng)度大約為650 bp，與預(yù)期大小一致。而Hela細(xì)胞未擴(kuò)增出特異性條帶。序列分析結(jié)果顯示，與GenBank公布的編號(hào)為NM 006850的序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)有兩處堿基的點(diǎn)突變，即223 bp處(G→A)伴隨著氨基酸的改變(Ala→Thr)和370 bp處

8、(T→C)伴隨著氨基酸的改變(Tyr→His)。②成功構(gòu)建人白介素24真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-hIL-24。③蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CaSki細(xì)胞的培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中都不能檢測(cè)到IL-24蛋白，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-hIL-24真核表達(dá)質(zhì)粒的CaSki細(xì)胞的培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中都能檢測(cè)到IL-24蛋白。 2．轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-hIL-24的CaSki細(xì)胞中HPV E6癌基因的mRNA水平明顯下降，

9、抑癌蛋白P53水平明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯升高。 3．①遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-hIL-24的CaSki細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少。②Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-hIL-24的CaSki細(xì)胞中MMP-2水平下降，p38 MAPK和E-cadherin水平升高。 4．共轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-hIL-24和pGensil-CH1組與單獨(dú)轉(zhuǎn)染組C

10、aSki細(xì)胞相比，HPV E6癌基因的mRNA水平明顯下降，抑癌蛋白P53水平明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯升高。 5．裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-hIL-24后的CaSki細(xì)胞成瘤能力明顯降低；對(duì)荷瘤裸鼠瘤內(nèi)注射pcDNA3.1(+)-hIL-24質(zhì)粒進(jìn)行基因治療后，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，腫瘤的體積與重量明顯低于對(duì)照組。病理檢查發(fā)現(xiàn)，處理組腫瘤生長(zhǎng)不佳，細(xì)胞分裂相少見(jiàn)，組織內(nèi)有較多壞死區(qū)域。 結(jié)論：

11、 1．蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CaSki細(xì)胞的培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中都不能檢測(cè)到IL-24蛋白，說(shuō)明可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，使IL-24 mRNA不能被翻譯成蛋白質(zhì)。而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-hIL-24真核表達(dá)質(zhì)粒的CaSki細(xì)胞的培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中都能檢測(cè)到IL-24蛋白，說(shuō)明構(gòu)建的pcDNA3.1(+)-hIL-24真核表達(dá)質(zhì)粒能在CaSki細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)分泌型的IL-24蛋白，且表達(dá)的蛋白具有免疫原性。 2．實(shí)驗(yàn)組CaSk

12、i細(xì)胞中HPV E6癌基因的mRNA水平明顯下降，抑癌蛋白P53水平顯著增加，促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明以真核表達(dá)載體介導(dǎo)的hIL-24基因在體外能顯著促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞的凋亡。 3．轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-hIL-24的CaSli細(xì)胞遷移和侵襲能力均下降，與MMP-2水平下降，E-cadherin水平升高相關(guān)。 4．用HPV-16 E6 siRNA與hL-24基因聯(lián)合誘導(dǎo)人宮頸癌CaSki細(xì)胞

13、的凋亡。本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果表明兩者兩者單獨(dú)使用時(shí)均能抑制E6癌基因的表達(dá)，聯(lián)合時(shí)則抑制效應(yīng)增強(qiáng)；Western blot結(jié)果顯示兩者單獨(dú)使用時(shí)，通過(guò)抑制E6癌基因的表達(dá)或其他一些途徑，均能使P53蛋白水平得到恢復(fù)，聯(lián)合時(shí)則效應(yīng)增強(qiáng)；流式結(jié)果顯示兩者聯(lián)合使用時(shí)具有協(xié)同效應(yīng)，能顯著提高腫瘤細(xì)胞凋亡率。 5．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-hIL-24后的CaSki細(xì)胞成瘤能力明顯降低；重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-hIL-24