高表達P2X7受體抑制宮頸癌Caski細胞生長的實驗研究.pdf

1、目的：檢測宮頸癌Caski細胞表面是否表達有功能的P2X7受體；探討在Caski細胞上穩(wěn)定高表達P2X7受體后對細胞生長的影響；進一步探討外源性三磷酸腺苷(ATP)對高表達P2X7受體的Caski細胞的生長影響。
　　方法：(1)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、流式細胞術(shù)(FCM)、免疫組化技術(shù)檢測宮頸癌上P2X7受體的表達。(2)將質(zhì)粒pcDNA6/V5-His-P2X7轉(zhuǎn)染至Caski細胞,用RT-PCR、Wester

2、n blotting、細胞免疫熒光等方法檢測P2X7受體在真核細胞內(nèi)的表達及定位,為檢測高表達P2X7受體對細胞生長的影響用MTT法檢測細胞增殖。(3)進一步檢測P2X7受體的天然配體ATP處理后對高表達細胞生長的影響,用MTT檢測細胞生存率,熒光染色法檢測線粒體膜電位的變化,FCM檢測細胞凋亡率以及Western blotting分析凋亡相關(guān)蛋白的變化。
　　結(jié)果：(1) RT-PCR、FCM、免疫組化結(jié)果表明在宮頸癌Caski

3、細胞上P2X7受體的表達減少。(2)穩(wěn)定細胞株的建立：通過抗性篩選獲得穩(wěn)定表達P2X7的Caski細胞株(Caski/P2X7)和陰性對照細胞株(Caski/3.1)。RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA6/V5-His-P2X7的Caski細胞出現(xiàn)約180bp條帶,陰性對照細胞株(Caski/3.1)無條帶出現(xiàn);Western blotting檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA6/V5-His-P2X7的Caski細胞出現(xiàn)約75KDa的目的條帶

4、;熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示在Caski細胞膜上有紅色熒光,表明有P2X7的蛋白表達,而陰性對照細胞未見熒光。MTT分析高表達P2X7受體后可抑制Caski細胞增殖。(3)用ATP處理Caski/P2X7和Caski/3.1細胞后,與對照細胞Caski/3.1比較,ATP處理后抑制Caski/P2X7細胞增殖較明顯(*,p<0.05);隨著ATP濃度的增加FCM結(jié)果顯示Caski/P2X7細胞凋亡率逐漸增加及線粒體膜電位逐漸降低;West