小腸ICC的分離和培養(yǎng)及高糖對(duì)體外培養(yǎng)的Cajal間質(zhì)細(xì)胞P2X7嘌呤能受體表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：胃腸動(dòng)力障礙是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的一個(gè)慢性并發(fā)癥，發(fā)病率較高。目前為止，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，一般認(rèn)為糖尿病胃動(dòng)力障礙主要與DM自主神經(jīng)病變和胃腸激素失衡有關(guān)，而DM的代謝紊亂，特別是糖代謝紊亂可能是產(chǎn)生本癥的基礎(chǔ)。現(xiàn)在其治療限于對(duì)癥治療，效果欠佳。因此，進(jìn)一步研究該病的發(fā)病機(jī)制及尋找更有效的治療方法或藥物意義重大。近年來越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cajal間質(zhì)細(xì)胞（Interstitial Cells

2、of Cajal，ICC）與其關(guān)系密切，引起人們廣泛關(guān)注。而ICC的分離和體外培養(yǎng)一直是個(gè)難題，也就阻礙了相關(guān)研究的發(fā)展。嘌呤受體是一類非腎上腺能非膽堿能（non-adrenergic non-cholinergic，NANC）受體，P2X7受體是其中一個(gè)較為特殊的受體，它具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，已成為研究熱點(diǎn)。
　　 目的：建立穩(wěn)定的ICC分離和體外培養(yǎng)方法。觀察P2X7嘌呤能受體在體外培養(yǎng)的ICC的表達(dá)情況、高糖對(duì)ICC形態(tài)及

3、其ICC上P2X7嘌呤能受體的影響，探討P2X7嘌呤能受體在糖尿病胃腸功能紊亂發(fā)生機(jī)制中的作用。
　　 方法：無菌條件下取出小鼠小腸組織，聯(lián)合使用機(jī)械分離法和酶解法分離細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于含有干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）的M199培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，ICC特異的c-Kit抗體進(jìn)行免疫熒光染色后，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行鑒定。在穩(wěn)定培養(yǎng)ICC的基礎(chǔ)上應(yīng)用ICC特異的c-Kit抗體和P

4、2X7受體抗體進(jìn)行免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行鑒定，以確定P2X7受體是否表達(dá)于ICC。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)，高糖組(葡萄糖濃度為33 mmol/L)。通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，RT-PCR對(duì)P2X7和c-Kit受體表達(dá)進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：倒置顯微鏡下觀察到ICC核大,有多個(gè)突起并有次級(jí)分支,相互之間連接形成網(wǎng)絡(luò),c-kit抗體熒光染色呈陽性。激光共聚焦顯微鏡下P2X7受體在c-

5、Kit抗體陽性的細(xì)胞上的免疫熒光染色是陽性的；與正常組比較，加入葡萄糖后的ICC細(xì)胞變大，突起變短，與周圍細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)連接減少；RT-PCR結(jié)果顯示,加入高糖后的ICC的c-Kit受體表達(dá)減弱，而P2X7受體的表達(dá)是增強(qiáng)的。
　　 結(jié)論：ICC的分離和培養(yǎng)是個(gè)難題，實(shí)驗(yàn)過程中我們對(duì)其方法、要點(diǎn)及注意事項(xiàng)進(jìn)行了探討，并獲得了成功。P2X7受體表達(dá)于體外培養(yǎng)的ICC上，高糖使ICC的形態(tài)發(fā)生了改變、減弱了c-Kit的表達(dá)、加強(qiáng)了P2X