巨噬細(xì)胞株中P2X7受體調(diào)控NALP3表達(dá)情況的研究.pdf

1、目的:
　　 各種急慢性炎癥性疾病在外科十分常見，如嚴(yán)重感染導(dǎo)致的急性炎癥是危重病人死亡的一個(gè)主要原因。巨噬細(xì)胞作為體內(nèi)重要的自然免疫細(xì)胞在各種急慢性炎癥性疾病中起重要作用，巨噬細(xì)胞活化后可產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)、活性氧等進(jìn)而引起機(jī)體的損傷。如何有效的控制機(jī)體的炎癥反應(yīng)，除應(yīng)用有效的抗生素外，還需阻斷參與感染連鎖反應(yīng)的炎癥介質(zhì)和機(jī)體細(xì)胞因子的作用。有報(bào)道革蘭陽性桿菌感染誘導(dǎo)caspase-1活化中特別需要NALP3炎癥復(fù)合體的參與，

2、而P2X7的活化導(dǎo)致的鉀離子流動(dòng)對NALP3炎癥復(fù)合體的激活具有重要意義。
　　 P2X受體屬于一類配體門控的，非選擇性的陽離子通道超家族。P2X7受體是P2X受體家族中獨(dú)特的一員，其在ATP刺激下，存在于細(xì)胞膜上的P2X7受體導(dǎo)致細(xì)胞膜的離子通道開放并形成貫通胞膜的孔道，調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性、細(xì)胞因子的釋放以及細(xì)胞凋亡，在小鼠巨噬細(xì)胞株p388d1細(xì)胞中表達(dá)P2X7受體。炎癥復(fù)合體(inflammasome)是胞漿內(nèi)一組復(fù)雜的多蛋白

3、復(fù)合體，它的主要功能是促進(jìn)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(capsase-1)的活化，從而可以促進(jìn)一些炎性細(xì)胞因子的分泌、活化和成熟，如白介素-18和白介素-1β(interleukin，IL-18和IL-1β)等。NALPs是一類NOD樣蛋白受體（為CARTERPILLER蛋白家族成員），而NALP3炎癥復(fù)合體是NALPs家族中的一員，是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種表達(dá)于細(xì)胞漿中的蛋白，NALP3能夠感受外源性、內(nèi)源性的配體，NALP3蛋白通過接頭蛋

4、白ASC來募集caspase-1來形成炎癥復(fù)合體，參與caspase-1的活化與IL-1β前體的成熟過程，NALP3炎癥復(fù)合體由NALP3、ASC、pro-caspase-1和Cardinal蛋白構(gòu)成。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過觀察小鼠巨噬細(xì)胞株p388d1細(xì)胞中激活P2X7受體后NALP3表達(dá)量的變化情況。擬證明P2X7受體與NALP3基因具有相關(guān)性，通過用ATP激活P2X7受體可引起NALP3表達(dá)量上調(diào)，即在小鼠巨噬細(xì)胞株p388d

5、1細(xì)胞中激活P2X7受體可以引起NALP3炎癥復(fù)合體的活化過程。
　　 方法:
　　 1.通過研究小鼠巨噬細(xì)胞株p388d1細(xì)胞中P2X7受體和NALP3炎癥復(fù)合體的相關(guān)性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)首先采用RT-PCR和westernblot方法檢測未經(jīng)處理的正常小鼠巨噬細(xì)胞株p388d1細(xì)胞中NALP3的表達(dá)情況。
　　 2.采用P2X7受體的天然激動(dòng)劑ATP激活P2X7受體，然后再采用RT-PCR和westernblot方

6、法檢測NALP3炎癥復(fù)合體中的主要成分NALP3在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。
　　 3.分別用P2X7受體和NALP3的干擾RNA，即P2X7-siRNA和NALP3-siRNA。采用轉(zhuǎn)染技術(shù)在小鼠巨噬細(xì)胞株p388d1細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染NALP3-siRNA、和同時(shí)轉(zhuǎn)入P2X7-siRNA及NALP3-siRNA。
　　 4.在經(jīng)過轉(zhuǎn)染處理的樣本中分別加入P2X7受體的天然激動(dòng)劑ATP，以ADP作為對照，分別用RT-P

7、CR和westernblot方法分別檢測敲除NALP3、以及同時(shí)敲除P2X7受體和NALP3時(shí)的NALP3的表達(dá)情況。同未經(jīng)處理的正常小鼠巨噬細(xì)胞株p388d1細(xì)胞中NALP3的表達(dá)量作對比。
　　 結(jié)果:
　　 1.RT-PCR和westernblot方法證明在正常的小鼠巨噬細(xì)胞株p388d1細(xì)胞中NALP3在mRNA水平和蛋白水平均有表達(dá)。
　　 2.采用P2X7受體的天然激動(dòng)劑ATP激活P2X7受體后，RT

8、-PCR和westernblot方法證明NALP3在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均具有上調(diào)的趨勢。
　　 3.在小鼠巨噬細(xì)胞株p388d1細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染NALP3-siRNA、和同時(shí)轉(zhuǎn)入NALP3-siRNA及P2X7-siRNA后加入P2X7受體的天然激動(dòng)劑ATP和對照物ADP后，RT-PCR和westernblot方法證明在沒有P2X7受體或者少量存在P2X7受體的情況下通過激活P2X7受體并沒有使NALP3的表達(dá)量存在明顯

9、的變化。
　　 結(jié)論:
　　 通過P2X7受體的天然激動(dòng)劑ATP激活P2X7受體后我們發(fā)現(xiàn)NALP3在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均具有上調(diào)的趨勢，而作為對照組加入ADP確沒有表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象出現(xiàn)。證明P2X7受體與NALP3確實(shí)具有相關(guān)性表達(dá)情況，即在小鼠巨噬細(xì)胞株p388d1細(xì)胞中激活P2X7受體可以介導(dǎo)NALP3的表達(dá)量上調(diào)。因此我們可以初步認(rèn)為在小鼠巨噬細(xì)胞株p388d1細(xì)胞中P2X7受體可能在NALP3炎癥復(fù)合體