P2X7-NALP3在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷中的作用.pdf

1、研究背景:
　　急性腎損傷(acute kidney injury, AKI),主要是由腎缺血或腎毒性藥物而導(dǎo)致的一類重癥疾病,臨床主要表現(xiàn)為血肌酐和尿素氮水平的急劇增高,其中絕大部分的患者腎臟病理表現(xiàn)為急性腎小管壞死(acute tubular necrosis, ATN)。目前已有的研究表明, AKI的主要發(fā)病機(jī)制包括線粒體破壞、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及腎小管上皮細(xì)胞壞死和凋亡等;其中炎癥及凋亡反應(yīng)在AKI的病程進(jìn)展中起著極其

2、重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),AKI腎組織中的炎性因子IL-1β及IL-18表達(dá)及腎小管上皮細(xì)胞凋亡顯著增加,很可能參與了AKI發(fā)病的過程。然而,AKI中誘發(fā)炎癥因子IL-1β、IL-18水平上調(diào)及腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加的具體機(jī)制迄今尚無研究報(bào)道。由于AKI有著十分復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制,且目前仍缺乏有效的治療手段,故關(guān)于AKI的具體發(fā)病機(jī)制及防治的研究已經(jīng)成為腎臟病學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題之一。
　　目前研究認(rèn)為,IL-1β、IL-18的活化以及細(xì)

3、胞凋亡均與嘌呤受體P2Xs(Purinergic receptor X, P2Xs)密切相關(guān)。P2Xs是陽離子通道型受體,活化后可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、活化下游信號(hào)通路、參與免疫反應(yīng)以及引起活性的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、IL-6等釋放。研究發(fā)現(xiàn),P2Xs嘌呤受體家族成員——P2X7受體在腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞等腎組織細(xì)胞中均有表達(dá),還與腎臟疾病狀態(tài)有著重要的聯(lián)系。P2X7作為NALP3(NLR family

4、, pyrin domain containing-3 protein,NLRP3 or NALP3)的主要的上游受體,與NALP3關(guān)系最為密切。NLRs(NOD like receptors)炎性體是近年發(fā)現(xiàn)的模式識(shí)別受體家族成員之一,NLRs受體根據(jù)N端效應(yīng)區(qū)域的不同,可分為NLRA、NLRB、NLRC及NLRP(NALP)四個(gè)亞型。NLRs是構(gòu)成炎性體的核心蛋白,而目前研究主要集中于NLRP1、NLRP3及NLRC4這3種亞型,發(fā)

5、現(xiàn)NLRP1、NLRP3及NLRC4均能發(fā)起炎性體的裝配。其中NLRP3炎性體又稱NALP3炎性體,主要由NALP3、ASC和caspase-1組成,在如新月體腎炎、狼瘡性腎炎等炎癥相關(guān)性腎病的過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。目前研究表明,P2X7受體活化是誘發(fā)NALP3炎性體活化的重要原因,同時(shí)也是導(dǎo)致促炎因子IL-1β、IL-18表達(dá)上調(diào)及細(xì)胞凋亡增加的重要始動(dòng)因素。還有研究發(fā)現(xiàn),壞死的小管上皮細(xì)胞可以引起成纖維細(xì)胞中 P2X7受體的表

6、達(dá)上調(diào),加重腎間質(zhì)纖維化程度,揭示了 P2X7受體可能與腎小管上皮細(xì)胞損傷存在密切關(guān)系。然而P2X7受體是否引起了AKI中促炎因子IL-1β、IL-18表達(dá)上調(diào)及腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加,NALP3炎性體活化是否是其重要機(jī)制,目前仍尚不十分清楚。
　　研究目的:
　　本研究擬先檢測(cè)AKI患者腎臟組織中促炎因子IL-1β、IL-18水平及小管上皮細(xì)胞凋亡情況,探討AKI患者腎組織中炎癥及凋亡反應(yīng)狀態(tài),并檢測(cè)患者腎組織中P2X7受

7、體及NALP3炎性體的表達(dá),探討AKI腎組織中促炎因子IL-1β、IL-18活化及小管上皮細(xì)胞凋亡的可能作用機(jī)制。同時(shí)建立順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷小鼠(C57B/6J)模型,并通過A-438079阻斷P2X7的活性,檢測(cè)AKI小鼠腎組織中P2X7受體、NALP3炎性體表達(dá)變化,并對(duì)AKI小鼠腎組織促炎因子IL-1β、IL-18表達(dá)水平、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、小管上皮細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),深入探討 P2X7受體在炎癥及凋亡反應(yīng)中的作用

8、及其可能的機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.臨床標(biāo)本有關(guān)實(shí)驗(yàn)
　　1.1.研究對(duì)象及分組
　　依照2005年9月急性腎臟損傷網(wǎng)絡(luò)(AKIN)推薦的 ATN診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取了2011年10月~2013年3月在第三軍醫(yī)大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科住院,臨床和腎活檢診斷為ATN的25例AKI患者,其中包括13例男性,12例女性,年齡在22.0~60.0歲間,平均39.0歲。選取9例來自腎錯(cuò)構(gòu)瘤患者外科手術(shù)后切除的正常的腎組織作為

9、對(duì)照組,其中包括3例男性,6例女性,年齡在17.0~34.0歲間,平均27.3歲。
　　1.2.檢測(cè)指標(biāo)及方法
　　收集并整理AKI患者入院時(shí)血肌酐(serum creatinine,Scr)及尿素氮(serum creatinine,BUN)等數(shù)據(jù),按照腎小球率過濾(estimated glomerular fitration rate, eGFR)的公式計(jì)算出AKI患者的eGFR值。對(duì)照組及AKI患者腎臟組織石蠟組織切片

10、,免疫組織化學(xué)測(cè)定AKI腎組織小管上皮細(xì)胞中P2X7、NALP3、caspase-1、caspase-3、IL-1β、IL-18的表達(dá)變化;TUNEL染色法檢測(cè)兩組腎組織中細(xì)胞凋亡情況并計(jì)數(shù)發(fā)生凋亡的細(xì)胞;觀察腎組織中腎小管損傷、腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況并進(jìn)行半定量積分后進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　40只,8-10周齡,雄性C57B/6J小鼠,隨機(jī)分為10只/組,包括對(duì)照組(腹腔注射生理鹽水0.2ml/只)、A-4

11、38079組(7mg/mlA-438079腹腔注射0.2ml/只)、順鉑組(AKI組,2mg/ml順鉑腹腔注射0.2ml/只)和A-438079干預(yù)組(A-438079+順鉑組,7mg/ml A-438079腹腔注射0.2ml/只6h后,2mg/ml順鉑腹腔注射0.2ml/只)。注射72h后,從各組中隨機(jī)取6只小鼠處死,留取血液及腎組織作以下檢測(cè):
　　2.1.采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)各組小鼠血清中Scr及BUN的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

12、r>　　2.2.采用PAS染色法對(duì)各組小鼠腎臟病理損傷情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.3.采用免疫熒光法對(duì)各組小鼠腎臟組織中P2X7受體的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.4.采用TUNEL法檢測(cè)各組腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況。
　　2.5.采用Western blot法對(duì)NALP3、ASC、caspase-1、caspase-3、P53、bax蛋白在各組小鼠腎臟組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.6.采用ELISA法對(duì)各組小鼠腎組織

13、中IL-1β和lL-18的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.臨床實(shí)驗(yàn)
　　1.1.一般情況
　　與對(duì)照組相比較,AKI組患者Scr及BUN水平均明顯增加(P<0.05),尿量及eGFR顯著降低(P<0.05)。
　　1.2.AKI患者腎小管上皮細(xì)胞中IL-1β、IL-18表達(dá)及凋亡情況與腎功能改變、腎小管損傷的關(guān)系
　　免疫組化結(jié)果提示,AKI組腎組織小管上皮細(xì)胞中IL-1β、IL-18的表達(dá)顯

14、著升高;TUNEL染色發(fā)現(xiàn),對(duì)照組腎組織小管上皮細(xì)胞凋亡較少,而AKI腎組織小管上皮細(xì)胞凋亡顯著增多(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析顯示,AKI患者腎組織中小管上皮細(xì)胞IL-1β、IL-18表達(dá)與小管損傷(r=0.580,r=0.531)、間質(zhì)炎細(xì)胞聚集(r=0.420,r=0.741)及 caspase-1表達(dá)(r=0.685,r=0.609)呈顯著正相關(guān)相關(guān),與eGRF(r=-0.511,r=-0.686)呈負(fù)相關(guān);腎小管

15、上皮細(xì)胞凋亡與小管損傷(r=0.743)、caspase-3的蛋白水平(r=0.482)均呈正相關(guān),與eGRF(r=-0.609)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。
　　1.3.AKI患者腎小管上皮細(xì)胞中P2X7與NALP3的表達(dá)情況與腎功能改變、腎小管損傷、炎癥因子表達(dá)及凋亡的關(guān)系
　　免疫組化結(jié)果提示,AKI腎小管上皮細(xì)胞P2X7、NALP3表達(dá)明顯升高,且分別與Scr(r=0.707,r=0.706)和BUN(r=0.584,

16、r=0.623)水平、腎小管損傷(r=0.787,r=0.530)、間質(zhì)炎癥(r=0.543,r=0.419)、caspase-1表達(dá)(r=0.666,r=0.687)、caspase-3表達(dá)(r=0.528, r=0.512)、IL-1β(r=0.558,r=0.555)及IL-18(r=0.459,r=0.574)的表達(dá)量、腎小管上皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)(r=0.719,r=0.671)成正相關(guān);與 eGFR(r=-0.622,r=-0.

17、59)成負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　2.1.順鉑誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性腎損傷。
　　(1)順鉑組:與對(duì)照組相比,順鉑腹腔注射72h后,小鼠 Scr及 BUN水平升高(P<0.05),且出現(xiàn)明顯的間質(zhì)炎細(xì)胞聚集和典型的急性腎損傷病理表現(xiàn)(P<0.05)。
　　(2)A-438079干預(yù)組:與順鉑組相比,順鉑腹腔注射72h后,小鼠血清中Scr及BUN含量增加程度不明顯( P<0.05),間質(zhì)炎細(xì)胞聚

18、集減少、小管病變明顯減輕(P<0.05),提示A-438079能有效地減輕順鉑誘導(dǎo)的腎組織損傷。
　　2.2.順鉑誘導(dǎo)AKI小鼠腎組織中P2X7受體表達(dá)上調(diào)。
　　(1)順鉑組:與對(duì)照組相比,順鉑腹腔注射72h后,小管上皮細(xì)胞中P2X7染色陽性的小管上皮顯著增多(P<0.05)。
　　(2)A-438079干預(yù)組:與順鉑組相比,P2X7表達(dá)明顯下降(P<0.05),表明A-438079能明顯降低P2X7受體的活性。

19、r>　　2.3.順鉑誘導(dǎo)AKI小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡增多。
　　(1)順鉑組:與對(duì)照組相比,順鉑腹腔注射72h后,凋亡的腎小管上皮細(xì)胞明顯增多(P<0.05);caspase-3、p53及bax的表達(dá)增加(P<0.05)。
　　(2)A-438079干預(yù)組:與順鉑組相比,凋亡的腎小管上皮細(xì)胞減少(P<0.05), caspase-3、p53及bax的表達(dá)下降(P<0.05),提示A-438079能有效地減少順鉑引起的小管上皮

20、細(xì)胞凋亡。
　　2.4.順鉑誘導(dǎo)AKI小鼠腎組織NALP3炎性體活化,IL-1β、IL-18水平升高。
　　(1)順鉑組:與對(duì)照組相比,順鉑腹腔注射72h后,小鼠腎組織NALP3、ASC和caspase-1蛋白顯著上調(diào)(P<0.05);促炎因子IL-1β及IL-18的含量較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)。
　　(2) A-438079干預(yù)組:與順鉑組相比,NALP3、ASC和caspase-1蛋白上調(diào)程度不明顯(P<0