人PCNA泛素化修飾在順鉑誘導的DNA損傷應答反應中作用的實驗研究.pdf

1、細胞在多種內外環(huán)境及化學物質不斷攻擊下會誘發(fā)DNA損傷。細胞首先通過DNA損傷檢查點，啟動細胞周期阻滯，進一步實施DNA修復或細胞凋亡。 增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)是一種表達水平隨細胞周期波動高度保守的生長調控蛋白，可圍繞DNA鏈組裝成三聚體滑動夾，是DNA聚合酶(polymerase，pol)polδ和polε的輔助因子。 近年來，大量研究表明蛋白質的多種

2、翻譯后修飾可參與調控蛋白質的生理活動，PCNA作為2002年第一個發(fā)現并證實非經典泛素化途徑(不引起蛋白的降解)修飾的蛋白，其泛素化修飾的研究一直是一個熱點。研究表明，在DNA損傷條件下，PCNAK164位點可發(fā)生泛素化。 在眾多外源性DNA損傷因素中，以紫外(UV)和順鉑(cisplatin)研究的最多。紫外照射主要形成干擾DNA復制的環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)和6-4光產物，主要通過核苷酸切除(NucleotideExcis

3、ionRepair,NER)過程進行DNA修復；順鉑作為臨床上常用的化療藥物，其主要是通過形成鉑-DNA加合物并造成DNA鏈內或鏈間交聯阻滯DNA復制，其修復途徑除了NER外，還涉及錯配修復、同源重組等。目前有關PCNA泛素化的研究多采用紫外線照射損傷為模型，且大多集中于探討PCNA泛素化在募集錯配傾向DNA聚合酶及在跨損傷復制中的作用。由于UV與順鉑損傷的作用機理有一定的相似性，那么PCNA泛素化修飾是否在順鉑所誘導的DNA損傷應答中

4、也發(fā)揮了重要的作用，或者這種應激反應只具有DNA損傷類型的特異性?PCNA泛素化在DNA誘導的細胞應激反應是否僅限于啟動跨損傷復制和復制后修復?在其它應激反應中，如細胞周期調控、細胞凋亡或DNA修復過程是否同樣也發(fā)揮著協同或拮抗作用?我們選用了損傷應答過程更為復雜的順鉑作為DNA損傷因素。另一方面，作為常規(guī)化療藥物，選擇順鉑損傷開展研究，有助于進一步深入了解順鉑耐藥性及誘導高突變產生等機制，從而具有重要的現實意義。 基于以上分析

5、，本課題主要圍繞PCNA泛素化修飾與順鉑損傷應答相關機制進行了實驗設計和研究.本實驗為進一步闡明PCNA泛素化修飾在DNA損傷應答中重要的生物學作用提供重要的研究線索。 方法： 1.重組人PCNA及其突變體mutantPCNA(mPCNA)真核表達質粒的構建及鑒定：以質粒pTAP-PCNA為模板進行PCR擴增，得到人PCNA的相應序列。將該序列片斷克隆至pGEM-TEasy載體中，經藍白斑篩選，獲得重組質粒pGEM-TE

6、asyPCNA，回收PCNA目的片斷。以測序正確的重組質粒pGEM-TEasyPCNA為模板采用一步反向PCR致突變法對重組質粒進行擴增、連接，并經雙酶切回收mutantPCNA目的片段，行序列測定。 2.PCNA及其突變體mPCNA穩(wěn)定高表達Hela細胞系的建立 2.1 PCNA及mPCNA真核表達質粒穩(wěn)定轉染Hela細胞：將Hela細胞經胰酶消化后，接種于35mm培養(yǎng)板中，24小時貼壁后，參照lipofectamin

7、eTM2000脂質體操作說明，將lipofectamineTM2000-DNA復合物加入培養(yǎng)板中，進行穩(wěn)定篩選。 2.2 順鉑誘導PCNA泛素化修飾的檢測：將穩(wěn)定高表達PCNA及mPCNA的Hela細胞消化鋪板，24小時貼壁后，加入順鉑使終濃度為15μmol/L，藥物作用4小時后，PBS洗3遍，加入不含藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，收取細胞全蛋白，以鼠抗人his抗體為一抗，以標記了HRP的羊抗鼠IgG為二抗，進行westernbl

8、ot方法顯色分析。 3.PCNA泛素化修飾對細胞順鉑敏感性及細胞凋亡的影響 3.1MTT法檢測細胞順鉑敏感性：將對數生長期的野生型Hela細胞及穩(wěn)定轉染的PCNA、mPCNA的Hela細胞，經胰酶消化后以適當濃度接種于96孔板中，第二天貼壁后，加入不同濃度的順鉑(5個復孔)設立陽性對照組及試驗組。藥物作用4小時后，PBS洗三遍，換入不含藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24小時后，加入MTT(5mg/ml)20ul/孔。培養(yǎng)4小時后

9、，翻板法倒盡板內液體，每孔再加入150ulDMSO，充分混勻，492nm測OD值，計算細胞的存活率：實驗組OD值/對照組OD值×100％。 3.2克隆形成法檢測細胞順鉑敏感性：將野生型Hela細胞及穩(wěn)定轉染PCNA、mPCNA的Hela細胞，經胰酶消化后以1000個/孔的密度接種于6孔板中。第二天貼壁后，加入不同濃度的順鉑，作用4小時后，PBS洗三遍，換入不含藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)約2周，直到長出肉眼可見克隆時，用PBS洗兩遍，再

10、用無水甲醇固定15分鐘，棄去，姬姆薩染色20min，計數大于50個細胞的克隆數，并計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?％)=克隆數/接種數×100％。 3.3細胞凋亡的檢測：將野生型Hela細胞及穩(wěn)定高表達mPCNA的Hela細胞消化鋪板，24小時貼壁后，加入順鉑使終濃度分別為15μmol/L和20μmol/L，藥物作用4小時后，PBS洗3遍，再加入不含藥物的培養(yǎng)基分別作用12h和24h后收取細胞。AnnexinV-FITC和PI雙染法

11、檢測分析細胞凋亡。 4.PCNA泛素化修飾對DNA損傷修復能力的影響：用順鉑在體外將PUG15-Luc質粒進行損傷，劑量為100μmol/L，時間為4h，重新將質粒進行提取和純化。損傷后的質粒瞬時轉染入野生型Hela細胞及穩(wěn)定高表達PCNA及mPCNA的Hela細胞，以未損傷的質粒為陽性對照，繼續(xù)培養(yǎng)使質粒得以充分修復和表達。48h后裂解細胞，檢測Luciferase報告基因的表達，并計算相對損傷修復率(％)=損傷質粒LucRL

12、U值/未損傷質粒LucRLU值×100％。 5.PCNA泛素化修飾對DNA損傷后細胞周期阻滯的影響：將野生型Hela細胞及穩(wěn)定高表達mPCNA的Hela細胞消化鋪板，24小時貼壁后，加入順鉑使終濃度為15μmol/L，藥物作用4小時后，PBS洗3遍，再加入不含藥物的培養(yǎng)基分別作用：12h、24h、36h，后收集細胞流式細胞儀對細胞周期進行檢測分析。 6.PCNA泛素化修飾對順鉑誘導產生的的基因突變作用機制的研究：用順鉑在

13、體外將含有SupF報告基因的穿梭質粒。PSupFG1進行損傷，將損傷后的質粒瞬時轉染入野生型Hela細胞及穩(wěn)定高表達mPCNA的Hela細胞；繼續(xù)培養(yǎng)使質粒得以充分修復和復制。48小時后，提取細胞內的supF質粒，用DpnI酶切三個小時，然后將其電轉入SY204細菌；將細菌鋪板在含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素的平板上，長出藍白斑，根據藍白斑數量計算突變頻率(％)=白色菌落/白色菌落+藍色菌落x100％。 結果： 1

14、.真核表達質粒pCDNA3.1/V5-HisA-PCNA和pCDNA3.1/V5-HisA-mPCNA經酶切、測序分析與實驗設計的序列完全一致。表達質粒瞬時轉染真核細胞后，westernblot結果顯示在相應位置可見清楚的目的條帶。 2.提取野生型及穩(wěn)定轉染PCNA和mPCNA的Hela細胞總蛋白，進行SDS-PAGE及westernblot分析. 3.MTT法：不同濃度順鉑作用后，野生型及穩(wěn)定轉染PCNA的Hela細胞

15、存活率從100％降到約82％，穩(wěn)定轉染mPCNA的Hela細胞存活率從100％降到23％，并呈劑量效應關系。 4.根據Luciferase報告基因檢測結果，計算出DNA的相對損傷修復率。野生型Hela:25％，Hela-PCNA:22％，Hela-mPCNA:23％。經統計學分析，Hela-mPCNA細胞與對照組相比損傷修復率沒有顯著差異。 5.細胞周期：與未處理的細胞(s:31％，24h)相比，順鉑處理后，野生型Hel

16、a細胞出現了明顯的s期阻滯(P＜0.05)，在24h達到59％，而穩(wěn)定轉染mPCNA的Hela細胞(S:33％，24h)幾乎沒有S期的阻滯。 6.將PSupFGl質粒成功轉入野生型及穩(wěn)定高表達PCNA及mPCNA的Hela細胞，提取出細胞內PSupFG1質粒，然后高效的將其轉入SY204細菌，最后鋪板數出藍白斑得出突變頻率：WT-Hela:2.58‰；PCNA-Hela:2.54‰；mPCNA-Hela:0.57‰。與對照組相比

17、，穩(wěn)定高表達mPCNA的Hela細胞其SupF基因突變率明顯降低。 結論： 1.成功建立了拮抗性抑制PCNA泛素化修飾的細胞模型。 2.PCNA泛素化修飾參與調控順鉑誘導的細胞凋亡性死亡，從而影響細胞順鉑敏感性。 3.PCNA泛素化修飾對順鉑誘導的DNA的損傷修復能力沒有顯著影響。 4.PCNA泛素化修飾可促進DNA損傷后在S期的細胞周期阻滯。 5.PCNA泛素化修飾在順鉑誘導產生的DNA