Nox4在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷中的功能及作用機(jī)制研究.pdf

1、急性腎損傷是一組以突發(fā)和持續(xù)的腎功能下降為特征的臨床綜合癥，是引起繼發(fā)性慢性腎臟病、腎衰竭及住院患者死亡的重要原因。其病理過(guò)程主要包括腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥、凋亡甚至是壞死等。前期的研究發(fā)現(xiàn)，順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷中存在ROS水平的變化，其來(lái)源存在多種途徑，其中NADPH oxidases的過(guò)度激活是氧化應(yīng)激水平升高的重要機(jī)制。NADPH oxidases是一個(gè)包含膜結(jié)合細(xì)胞色素b558和細(xì)胞溶質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白的多組分酶。在腎臟組織中主要存在N

2、ox4亞型的表達(dá)，并且Nox4在腎臟疾病中的作用受到廣泛關(guān)注，例如，Nox4參與糖尿病腎病、腎腫瘤等腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。然而目前關(guān)于Nox4在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷中的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題分別設(shè)計(jì)體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)，研究在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷中，Nox4的作用及可能涉及的調(diào)控機(jī)制，為防止急性腎損傷尋找新的策略。本課題的主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)部分：
　　1.體外實(shí)驗(yàn)，用NAC預(yù)處理HK2細(xì)胞，檢測(cè)NAC抑制順鉑誘導(dǎo)的KIM-1蛋白與m

3、RNA、相關(guān)炎癥因子mRNA水平以及RIP-mediated necroptosis和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　體外實(shí)驗(yàn)以HK2細(xì)胞為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為三組：正常組；模型組用Cisplatin(20uM)處理細(xì)胞24h;NAC組用NAC(50uM)預(yù)處理12h，然后給予順鉑刺激24h。分別提取各組細(xì)胞的蛋白與RNA,通過(guò)Western blot、Real-time PCR、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)方法，檢測(cè)ROS與腎損傷程度相關(guān)指標(biāo)的水

4、平。結(jié)果表明，順鉑促進(jìn)ROS表達(dá)的上調(diào)。同時(shí)，抑制ROS可以減輕順鉑誘導(dǎo)的腎損傷程度。提示ROS參與順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷過(guò)程。
　　2.在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，NADPH oxidases阻斷劑apocynin抑制順鉑誘導(dǎo)的KIM-1蛋白與mRNA、相關(guān)炎癥因子mRNA水平以及降低RIP-mediated necroptosis和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　1）體外實(shí)驗(yàn)以HK2細(xì)胞為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為三組：正常組；模型組使用Cispla

5、tin(20uM)刺激細(xì)胞24h;Apo組先用apocynin(100uM)預(yù)處理12h后,給予順鉑刺激24h。通過(guò)Western blot、Real-time PCR、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)水平。結(jié)果表明，apocynin顯著地抑制順鉑誘導(dǎo)的腎損傷因子(KIM-1)的蛋白與RNA水平；同時(shí)降低順鉑引起的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡與壞死；而且抑制RIP-mediated necroptosis相關(guān)蛋白(RIP1/RIP3/P-M

6、LKL)和凋亡相關(guān)蛋白(cleaved-caspase3)水平，并且抑制了炎癥相關(guān)因子(TNF-α/IL-1β/IL-6/MCP-1)的mRNA水平。提示NADPH oxidases參與順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷過(guò)程。
　　2）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將小鼠分為正常組、Cisplatin組、Cispaltin+apocynin組，每組8只小鼠，正常組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水；Cisplatin組小鼠腹腔注射順鉑(20mg/kg)，建立急性腎損傷模

7、型；Cisplatin+apocynin組小鼠腹腔注射apocynin(100mg/kg)，第二天給小鼠腹腔注射順鉑(20mg/kg)。腹腔注射順鉑3天后處死小鼠采集血樣與收集腎組織，通過(guò)病理學(xué)、血清學(xué)、Western blot與Real-time PCR等方法檢測(cè)其相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，Cispaltin組病理學(xué)、血清學(xué)、Western blot、Real-time PCR等方法檢測(cè)指標(biāo)均顯著增高；與Cisplatin組相

8、比，Cisplatin+apocynin組病理學(xué)、血清學(xué)、Western blot、Real-time PCR等方法檢測(cè)的指標(biāo)均顯著降低，提示apocynin可以減輕順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型腎臟的損傷程度。
　　3.在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，Nox4促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的KIM-1蛋白與mRNA、相關(guān)炎癥因子mRNA水平以及RIP-mediated necroptosis和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　1）在體外實(shí)驗(yàn)中，與正常組相比，cisplat

9、in刺激的HK2細(xì)胞組，顯著上調(diào)Nox4蛋白與mRNA水平；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給小鼠腹腔注射順鉑(20mg/kg)，建立急性腎損傷模型，三天后處死小鼠，通過(guò)IHC、Western blot和Real-time PCR方法發(fā)現(xiàn)，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的腎臟組織中，存在Nox4蛋白與mRNA水平的高表達(dá)。因此，本課題著眼于NADPH oxidases家族中Nox4在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷中的研究。
　　2）在HK2細(xì)胞上，用shRNA

10、干擾技術(shù)靶向沉默Nox4，用順鉑(20uM)刺激HK2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默Nox4可以顯著抑制順鉑誘導(dǎo)的KIM-1蛋白與mRNA水平，另外沉默 Nox4可以抑制順鉑誘導(dǎo)的 RIP-mediated necroptosis相關(guān)蛋白R(shí)IP1/RIP3/P-MLKL以及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3的表達(dá)，同時(shí)也顯著降低炎癥因子TNF-α、IL-1β與IL-8的水平。提示，Nox4通過(guò)RIP-mediated necroptos

11、is、凋亡與炎癥機(jī)制影響順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷過(guò)程。
　　3）在HK2細(xì)胞上，轉(zhuǎn)染Nox4質(zhì)粒，用順鉑（20uM）刺激HK2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Nox4可以促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的KIM-1蛋白與mRNA水平，另外過(guò)表達(dá)Nox4可以促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的RIP-mediated necroptosis相關(guān)蛋白R(shí)IP1/RIP3/P-MLKL以及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3的表達(dá)，同時(shí)也可以顯著促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β與IL

12、-8的水平。提示，Nox4通過(guò)RIP-mediated necroptosis、凋亡及炎癥機(jī)制促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷過(guò)程。
　　4．在Nox4過(guò)表達(dá)細(xì)胞株上，ROS阻斷劑NAC抑制Nox4促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)KIM-1蛋白與mRNA、相關(guān)炎癥因子mRNA水平以及RIP-mediated necroptosis和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　在Nox4過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株上，給予NAC(50uM)預(yù)處理12h，隨后給予順鉑(20uM)刺激24h

13、,實(shí)驗(yàn)被分為六組分別為Control組；Nox4 OE組；Control+Cispaltin組;Nox4 OE+Cispaltin組；Control+Cispaltin+NAC組;Nox4 OE+Cispaltin+NAC組。通過(guò)Westrn blot與Real-time PCR方法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC抑制Nox4對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷的促進(jìn)作用。提示，Nox4可能是通過(guò)ROS介導(dǎo)的RIP-mediated necroptos

14、is、凋亡及炎癥機(jī)制促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷過(guò)程。
　　5.給小鼠尾靜脈注射慢病毒包裝的Nox4 shRNA，在體沉默Nox4減輕順鉑誘導(dǎo)的小鼠功能與組織的損傷以及降低RIP-mediated necroptosis和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)小鼠被隨機(jī)分為六組：Normal組；Vector組；Nox4 KD組；Normal+Cisplatin組；Vector+Cisplatin組；Nox4 KD+Cisplatin組；通過(guò)尾靜脈給 No

15、x4 KD和 Nox4 KD+Cisplatin組的小鼠注射慢病毒包裝的Nox4 shRNA，一周后，給對(duì)應(yīng)模型組的小鼠腹腔注射順鉑(20mg/kg)，建立急性腎損傷模型。三天后處死各組小鼠，取血樣和腎臟組織，通過(guò)組織學(xué)、血清學(xué)、Western blot和Real-time PCR等方法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。與Normal+Cisplatin組或Vector+Cisplatin組相比，Nox4 KD組中的PAS染色、KIM-1的蛋白與mRNA水

16、平、RIP-mediated necroptosis相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白的水平以及炎癥相關(guān)指標(biāo)的水平均明顯降低，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，在體沉默Nox4可以降低順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷過(guò)程，即Nox4可能作為順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷的治療靶點(diǎn)。
　　6.在腫瘤細(xì)胞上沉默Nox4不影響腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤的治療作用
　　在體外，建立Nox4沉默腫瘤細(xì)胞株(包括BEL7401，SGC-7901，C6細(xì)胞)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默Nox4可以明顯