RGC‐32在急性腎損傷腎小管修復(fù)中的作用及可能機(jī)制.pdf

1、急性腎損傷（Acute Kidney Injury，AKI）為臨床常見(jiàn)危重癥，指多種原因引起的腎小球?yàn)V過(guò)率（Glomerular Filtration Rate，GFR）突然下降，臨床表現(xiàn)為氮質(zhì)血癥、水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂以及全身各系統(tǒng)癥狀。盡管人類對(duì)AKI的診斷治療水平尤其是腎臟替代技術(shù)有了長(zhǎng)足進(jìn)步，但AKI死亡率仍高達(dá)5％‐10%，伴腎外器官衰竭患者可達(dá)50%‐70%。此外，AKI是引發(fā)慢性腎功能不全常見(jiàn)原因之一。急慢性腎損傷已經(jīng)成

2、為威脅人類健康的重要疾病。因此，積極尋找AKI發(fā)生及發(fā)展機(jī)制，對(duì)AKI進(jìn)行早期診斷及治療一直是全球腎臟病研究者的熱門課題。
　　腎臟急性缺血缺氧再灌注損傷（Acute Ischemia‐reperfusion Kidney Injury，AIKI）是臨床最常見(jiàn)的AKI病因之一，其主要病理特征為急性腎小管壞死。研究表明，急性腎小管壞死發(fā)生后細(xì)胞周期循環(huán)在腎小管修復(fù)過(guò)程中起著極其重要的作用。業(yè)已證明，補(bǔ)體應(yīng)答基因‐32（Respons

3、e Gene to Complement32，RGC‐32）為細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控分子，促進(jìn)細(xì)胞周期循環(huán)參與細(xì)胞增生。本研究第一部分在建立 AIKI動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blotting以及免疫組織化學(xué)等方法觀察了RGC‐32在AIKI大鼠腎組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化及分布，并初步了解其在AIKI大鼠腎組織中的表達(dá)規(guī)律及其意義。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腎缺血再灌注損傷24h后，RGC‐32在腎組織表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下調(diào)并持續(xù)

4、至缺血再灌注后72h，術(shù)后1周其表達(dá)量逐漸上升至基本正常水平，提示RGC‐32可能在急性腎損傷過(guò)程中發(fā)揮作用。隨后，為明確RGC‐32在大鼠AIKI過(guò)程中的可能機(jī)制，本研究第二部分通過(guò)體外腎小管上皮細(xì)胞損傷模型，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)干預(yù)RGC‐32表達(dá)，進(jìn)一步觀察了RGC‐32對(duì)腎小管上皮細(xì)胞損傷及修復(fù)的影響。
　　第一部分：RGC‐32在急性腎損傷大鼠腎組織中的表達(dá)及意義
　　【目的】：
　　通過(guò)建立大鼠AIKI模型，觀

5、察RGC‐32在AIKI大鼠腎組織中表達(dá)變化與分布規(guī)律，了解RGC‐32在AIKI中的意義。
　　【方法】：
　　采用國(guó)際公認(rèn)的雙側(cè)腎蒂夾閉法建立AIKI模型，SD大鼠隨機(jī)分組：
　　（1）模型組（AIKI組）（n=64）：分離大鼠雙側(cè)腎蒂，持續(xù)阻斷45min。并分別于腎臟缺血再灌注后2h、6h、24h、48h、72h、1w、2w、4w分別處死大鼠8只。通過(guò)腹主動(dòng)脈采血檢測(cè)血清肌酐（Serum Creatinine，S

6、cr）水平。留取腎臟組織，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blotting以及免疫組織化學(xué)法明確腎組織損傷程度及RGC‐32表達(dá)變化與分布規(guī)律。
　?。?）假手術(shù)組（sham組）（n=64）：僅分離雙側(cè)腎蒂而不進(jìn)行腎蒂阻斷，其余操作同AIKI組。
　　【結(jié)果】：
　?。?）通過(guò)免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)：正常大鼠腎組織中RGC‐32主要表達(dá)于近端小管、遠(yuǎn)端小管及集合管上皮細(xì)胞，腎小球僅有微弱表達(dá)；RGC‐32在腎小管

7、間質(zhì)及腎臟血管無(wú)表達(dá)。
　?。?）AIKI組缺血再灌注后2h、6h、24h、48h、72h、1w、2w、4w RGC‐32蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.0168±0.0029,0.0156±0.0021,0.0065±0.0013,0.0075±0.0013,0.0096±0.0014,0.0132±0.0016,0.0169±0.0014,0.0179±0.0022。其中缺血再灌注后24h、48h、72h兩組間RGC‐32蛋白表達(dá)水

8、平差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。RGC‐32 mRNA表達(dá)水平變化與免疫組化結(jié)果相符。RGC‐32蛋白表達(dá)與腎小管‐間質(zhì)損傷評(píng)分存在顯著負(fù)相關(guān)（r=‐0.514，P<0.01）。
　　【結(jié)論】：
　?。?）首次發(fā)現(xiàn) RGC‐32蛋白在正常SD大鼠腎組織中主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿，腎小球系膜細(xì)胞可有微弱表達(dá)，腎血管及腎小管間質(zhì)無(wú)表達(dá)。
　?。?）大鼠腎臟缺血再灌注后，RGC‐32于再灌注后24h‐72h表達(dá)

9、水平明顯降低。RGC‐32可能在AKI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分：RGC‐32通過(guò)細(xì)胞周期參與腎小管上皮細(xì)胞損傷及修復(fù)過(guò)程
　　【目的】：
　　通過(guò)體外腎小管損傷模型，研究 RGC‐32對(duì)腎小管上皮細(xì)胞周期影響以及參與腎小管上皮細(xì)胞損傷修復(fù)過(guò)程的作用。
　　【方法】：
　　（1）體外培養(yǎng) NRK‐52E細(xì)胞，TNF‐α（10ng/ml）干預(yù)制備體外腎小管上皮細(xì)胞損傷模型并鑒定。
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10、2）采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)分別轉(zhuǎn)染RGC‐32真核表達(dá)載體和RGC‐32 siRNA，制備RGC‐32高表達(dá)組及RGC‐32敲低組，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。
　?。?）通過(guò)流式細(xì)胞儀，檢測(cè)RGC‐32高表達(dá)組及RGC‐32敲低組細(xì)胞周期變化。
　　（4）Western blotting方法檢測(cè)各組細(xì)胞損傷標(biāo)志物及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)。
　　【結(jié)果】：
　?。?）與對(duì)照組相比，RGC‐32敲低組G2/M期比例明顯增多（P<0.05）；R