胚胎干細(xì)胞體外分化為腎小管上皮細(xì)胞分子機(jī)制及其在腎損傷修復(fù)中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的：由于抗生素以及抗腫瘤藥物的廣泛應(yīng)用，而腎臟又是一個(gè)藥物毒性頻繁作用的器官，因此近年來藥物性腎損傷發(fā)病率逐年提高，已經(jīng)成為危害人們身體健康的一大疾病。由于腎小管上皮細(xì)胞對(duì)于許多藥物具有分泌和重吸收功能，因而細(xì)胞內(nèi)藥物濃度較高，所以這一類疾病中，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死發(fā)生率較高。藥物性腎損害程度較輕時(shí)，主要表現(xiàn)為急性腎小管損傷，損傷較重時(shí)表現(xiàn)為急性腎小管壞死。前者通常是可逆性的加上腎臟本身也具有一定的修復(fù)功能，因此可以通過適

2、當(dāng)?shù)膶?duì)癥治療得到治愈；而后者常由于治療不及時(shí)而引起腎功能衰竭，最終導(dǎo)致患者死亡。目前對(duì)于腎功能衰竭常用的透析療法，如持續(xù)性的腎臟替補(bǔ)療法對(duì)于總的致死率沒有什么影響，而最有效的治療手段-腎臟移植，常常由于供體腎臟來源少，且引起免疫排斥反應(yīng)從而導(dǎo)致治療效果較差，上述原因使得人們?cè)絹碓疥P(guān)注細(xì)胞治療。ES細(xì)胞是從動(dòng)物早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞分離出來的具有發(fā)育全能性的一種未分化的無限增殖的細(xì)胞系，具有向三個(gè)胚層分化的潛能。胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)

3、體外均能分化成各種類型的細(xì)胞，而在特定微環(huán)境中能向特定類型的細(xì)胞分化。這些顯著的特性使得ES細(xì)胞成為細(xì)胞治療的首選供體來源。到目前為止，誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化的研究已取得了有意義的進(jìn)展，但尚未見到誘導(dǎo)其分化為腎上皮細(xì)胞及其相關(guān)分化機(jī)制探討的報(bào)道。同時(shí)對(duì)于ES細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)藥物性腎損傷的治療作用也無報(bào)道。本研究將腎上皮細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞共同培養(yǎng)并在培養(yǎng)基中添加不同的化學(xué)或生物試劑，其目的在于體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向腎小管上皮樣細(xì)胞分化，并探討分化過

4、程中所涉及的分子機(jī)制；同時(shí)利用順鉑建立腎損傷小鼠模型，利用此模型初步探討胚胎干細(xì)胞對(duì)損傷腎的修復(fù)作用以及ES細(xì)胞在體內(nèi)的分化情況。這一部分主要側(cè)重于修復(fù)作用的觀察。 第一部分：體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向腎小管上皮樣細(xì)胞分化模型的建立方法：(1)條件培養(yǎng)基收集及配制：腎小管上皮細(xì)胞(TCMK-1)單層培養(yǎng)48小時(shí)后，收集培養(yǎng)基，離心，過濾，備用。將不含LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)基與腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基按3∶1混和，配制成條件培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)?/p>

5、用。(2)建立胚胎干細(xì)胞(ES)向腎小管上皮細(xì)胞(TCMK-1)分化體外模型：cellcultureinserts多孔膜做為基膜的替代物，將EScells懸浮培養(yǎng)形成的EBs和TCMK-1分別種在膜兩側(cè)，這兩種細(xì)胞可以經(jīng)膜上的孔(基膜上的窗孔)形成類似活體中細(xì)胞與細(xì)胞間樣接觸，同時(shí)TCMK-1細(xì)胞分泌的因子也可以通過窗口作用于ES細(xì)胞，此組做為接觸共培養(yǎng)組；將ES細(xì)胞形成EBs直接種在鋪有g(shù)elatin的平皿上，利用條件培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分

6、化培養(yǎng)，此組作為條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)組；將ES細(xì)胞形成EBs直接種在鋪有g(shù)elatin的平皿上，利用不合LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，此組作為自由分化組。在0、4、7、10、13、16、19d用熒光顯微鏡，RT-PCR技術(shù)以及免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化，腎臟發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)情況，并在0、4、8、12、16、20、24d利用RT-PCR以及免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測(cè)腎上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白Ksp-cadherin的表達(dá)情況。 第二部分

7、：Wnt-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胚胎干細(xì)胞體外分化為腎小管上皮細(xì)胞過程中作用的研究方法：利用第一部分建立的誘導(dǎo)ES細(xì)胞向腎小管上皮細(xì)胞分化模型來研究Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在ES細(xì)胞分化過程中的作用，在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要分子以及腎臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況：設(shè)ES細(xì)胞與腎小管上皮細(xì)胞接觸共培養(yǎng)體系，將培養(yǎng)基中加入啟動(dòng)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的化學(xué)物質(zhì)LiCl作為LiClgroup；無LiCl作為Experimentgroup；培養(yǎng)基中

8、加入Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制物anti-wnt-4抗體作為anti-wnt-4group。檢測(cè)指標(biāo)：(1)在誘導(dǎo)后不同的時(shí)間點(diǎn)即：3d，5d，7d，9d，11d，13d利用RT-PCR和Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)EB中Pax-2，Wnt-4，F(xiàn)rizzled-4，F(xiàn)rizzled-6mRNA的表達(dá)情況，以及在3d，7d，11d，15d，19d，23d檢測(cè)Ksp-cadherinmRNA的表達(dá)情況；(2)觀察Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號(hào)分

9、子的表達(dá)情況：根據(jù)LiClgroupRT-PCR結(jié)果顯示的Wnt-4mRNA的表達(dá)時(shí)間，即從誘導(dǎo)后第5d，7d，9d，11d，13d利用免疫印跡法檢測(cè)β-catenin非磷酸化狀態(tài)的表達(dá)情況。(3)觀察Wnt-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)ES細(xì)胞體外分化為腎上皮細(xì)胞的影響：同樣根據(jù)RT-PCR結(jié)果，在各組ES細(xì)胞分化不同時(shí)間點(diǎn)即：15d，19d，23d利用免疫組織熒光化學(xué)方法檢測(cè)ES細(xì)胞中Ksp-cadherin蛋白表達(dá)情況；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ES

10、細(xì)胞的分化率。結(jié)果：(1)RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入LiCl的ES細(xì)胞中腎臟發(fā)育相關(guān)基因即pax-2，wnt-4，frizzled和ksp-cadherin的表達(dá)時(shí)間均早于其他兩組(p＜0.01)，LiCl組中Pax-2mRNA于誘導(dǎo)后第3天開始表達(dá)，而兩外兩組均于第5天開始表達(dá)，LiCl組中此基因在誘導(dǎo)后第9天表達(dá)開始下降；Wnt-4mRNA在誘導(dǎo)后第5天開始表達(dá)，隨著分化時(shí)間的延長其表達(dá)量逐漸增加，實(shí)驗(yàn)組和Anti-wnt-4組

11、此基因的表達(dá)時(shí)間分別為7天和11天；Frizzled-6mRNA的表達(dá)時(shí)間和趨勢(shì)與Wnt-4mRNA相似；實(shí)驗(yàn)中我們未檢測(cè)出Frizzled-4mRNA的表達(dá)；Ksp-cadherinmRNA在LiCl組的表達(dá)時(shí)間為誘導(dǎo)后第11天，Experiment組表達(dá)此蛋白的時(shí)間為誘導(dǎo)后15天，表達(dá)量明顯低于LiCl組(p＜0.01)，Anti-wnt-4組中沒有此基因的表達(dá)。(2)Westernblotting實(shí)驗(yàn)表明，LiCl組中在wnt-4

12、基因表達(dá)后，非磷酸化β-catenin的表達(dá)量開始逐漸增加，Experiment組此蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與LiCl組中相似，但是表達(dá)量低于前一組(p＜0.01)。Anti-wnt-4組中非磷酸化β-catenin的表達(dá)量低于前兩組，隨著細(xì)胞分化其表達(dá)量有下降的趨勢(shì)。(3)免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示ksp-cadherin陽性細(xì)胞率在LiCl組中明顯高于實(shí)驗(yàn)組(p＜0.01)。結(jié)論：在實(shí)驗(yàn)中我們利用氯化鋰抑制β-catenin的降解間接促進(jìn)W

13、nt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并利用Wnt-4抗體抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來觀察不同組ES細(xì)胞分化情況，從而分析此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯化鋰組腎上皮細(xì)胞陽性率明顯高于實(shí)驗(yàn)組，而有Wnt-4抗體組未檢測(cè)出腎上皮細(xì)胞，據(jù)上述結(jié)果我們認(rèn)為在ES體外分化為腎上皮細(xì)胞的過程中，Wnt-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)Wnt-4與其受體Frizzled-6而不是Frizzled-4結(jié)合啟動(dòng)經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過改變?chǔ)?catenin的表達(dá)發(fā)揮著重要作

14、用。 第三部分：ES細(xì)胞在小鼠急性腎小管壞死修復(fù)中的作用方法：選取2月齡的BALB/C雌性或雄性小鼠，按12.7mg/kg經(jīng)小鼠尾靜脈注射順鉑，建立藥物性急性腎損傷小鼠模型。將ES細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞以及生理鹽水同樣經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，分別設(shè)為ES細(xì)胞治療組、腎小管上皮細(xì)胞治療組和生理鹽水注射組。一段時(shí)間后，HE染色檢測(cè)小鼠腎臟病理變化；抽血檢測(cè)小鼠血常規(guī)、血中尿素氮和肌酐的變化；RT-PCR檢測(cè)GFP基因的表達(dá)情況；免疫熒光

15、技術(shù)檢測(cè)小鼠腎臟中GFP的表達(dá)情況。結(jié)果：HE染色結(jié)果表明：藥物注射后第4天，小鼠腎臟病理解剖結(jié)果腎小管上皮細(xì)胞呈空泡樣變性，部分細(xì)胞壞死脫落入管腔，基底膜暴露；28天時(shí)腎損傷逐漸修復(fù)。血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ES細(xì)胞注射后第4天，實(shí)驗(yàn)組小鼠血中BUN、Scr的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組；ES細(xì)胞植入損傷小鼠后5天，RT-PCR檢測(cè)出小鼠GFPmRNA的表達(dá)；第6天免疫熒光檢測(cè)出小鼠腎臟中有GFP蛋白的表達(dá)。結(jié)論：在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們成功的建立

16、了藥物性急性腎損傷小鼠模型，并利用此模型研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)也能分化成腎小管上皮細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞的此分化能力具有很強(qiáng)的環(huán)境依賴性。腎臟內(nèi)的局部微環(huán)境對(duì)胚胎干細(xì)胞向腎小管上皮細(xì)胞分化的潛能中發(fā)揮著重要作用。因此胚胎干細(xì)胞有望成為急性腎功能衰竭的細(xì)胞替代治療的重要來源。 創(chuàng)新點(diǎn)和意義：1、本研究首次體外模擬體內(nèi)腎臟微環(huán)境誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為腎小管上皮樣細(xì)胞，為探索腎臟發(fā)育機(jī)制打下基礎(chǔ)。該模型的建立和對(duì)ES分化為腎小管上皮細(xì)胞機(jī)制

17、的研究，必將促進(jìn)急性腎衰等相關(guān)的臨床研究的發(fā)展，并推動(dòng)其臨床應(yīng)用。2、我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Wnt-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在ES細(xì)胞體外分化為腎上皮細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用。我們首次發(fā)現(xiàn)在體外ES細(xì)胞分化為腎上皮細(xì)胞的過程中，Wnt-4與其受體Frizzled-6而不是Frizzled-4結(jié)合，通過促進(jìn)β-catenin非磷酸化狀態(tài)的表達(dá)，即通過經(jīng)典的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用。3、首次研究了胚胎干細(xì)胞在藥物性急性腎損傷中的治療作用，這必將推動(dòng)胚