microRNA-17-5p在急性腎損傷發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　急性腎損傷(Acute Kidney Injury，ANI)是臨床非常常見(jiàn)，花費(fèi)極高且造成住院病人死亡率明顯增加的危重癥，其發(fā)病率約為2‰?；颊叩念A(yù)后直接取決于AKI的嚴(yán)重程度，甚至是極輕微的血清肌酐水平變化也不可忽視。近年研究表明發(fā)生AKI后，損傷最早出現(xiàn)在近端腎小管上皮細(xì)胞，并表現(xiàn)為各種形式的細(xì)胞死亡，而腎臟功能的恢復(fù)則依賴(lài)于那些存活下來(lái)的腎小管上皮細(xì)胞，通過(guò)去分化及增殖以重建腎單位。因此增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞對(duì)損傷的

2、抵抗力，提高其存活率，即為有益于損傷后的修復(fù)進(jìn)程，亦對(duì)治療和預(yù)后有著不可小覷的意義。近年來(lái)，雖然對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡的定義及分類(lèi)已有較為明確的結(jié)論，但損傷后誘發(fā)其凋亡的使動(dòng)因素及相關(guān)機(jī)制尚不清楚，而探尋上游基因水平調(diào)控機(jī)制對(duì)于治療甚至于預(yù)防AKI都有非凡的臨床價(jià)值。
　　MicroRNAs（miRNAs）是一類(lèi)具有基因表達(dá)調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因mRNA的翻譯過(guò)程及其在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性從而抑制靶基因表達(dá)

3、（圖1）。至少有1000個(gè)miRNAs經(jīng)生物信息學(xué)分析參與人體幾乎所有細(xì)胞進(jìn)程的調(diào)控，其表達(dá)水平的改變與很多疾病的病理過(guò)程密切相關(guān)。在眾多miRNAs中，miRNA17簇（miRNA17 cluster，miR17～92）是研究最為廣泛的一組miRNAs。miR17～92的缺失不僅發(fā)現(xiàn)直接影響動(dòng)物肺部及心血管系統(tǒng)的發(fā)育，還對(duì)損傷后病理及修復(fù)過(guò)程的調(diào)控至關(guān)重要。近期腎臟方面的研究證實(shí)miR17～92的缺陷使得小鼠腎臟細(xì)胞增殖受到抑制，腎單

4、位數(shù)量減少，6周齡即出現(xiàn)蛋白尿，3月齡出現(xiàn)腎小球硬化。同時(shí)miRNAs在AKI中的作用也逐漸成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)，美國(guó)喬治亞攝政大學(xué)（前喬治亞州醫(yī)學(xué)院）首次使用Dicer（miRNA生物合成的關(guān)鍵酶）近端腎小管細(xì)胞特異性敲除鼠證實(shí)，在腎臟缺血再灌注損傷（Renal Ischemia ReperfusionInjury，IRI）動(dòng)物模型中總體miRNAs耗竭減緩了缺血性損傷。而令人振奮的是隨后有研究者發(fā)現(xiàn)miR-17～92中最主要的miR

5、NA，即miR-17主鏈(miR-17-5p)在IRI后的修復(fù)階段被激活，但并未深入研究這一活化對(duì)于腎小管上皮細(xì)胞的抗凋亡能力及腎臟的再生修復(fù)是否有利，以及其作用機(jī)制如何尚不清楚。
　　本課題的目的是觀察miR-17-5p在急性腎損傷中的作用及對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步探討miR-17-5p上下游信號(hào)通路的調(diào)控作用，為AKI的治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、AKI體內(nèi)、體外模型及miR-

6、17-5p的表達(dá):
　　(1)體內(nèi)動(dòng)物模型:8-12周齡雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham）、缺血再灌注損傷無(wú)修復(fù)模型組、缺血再灌注損傷伴修復(fù)模型組。缺血再灌注損傷無(wú)修復(fù)模型組小鼠給予雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉缺血30分鐘松夾再灌注手術(shù)處理，分別于急性損傷期即再灌注12小時(shí)(I30R12h)和損傷晚期即再灌注48小時(shí)(I30R48h)處死動(dòng)物，留取腎皮質(zhì)組織并提取組織總RNA。缺血再灌注損傷伴修復(fù)模型組小鼠給予雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉缺

7、血25分鐘松夾再灌注手術(shù)處理，分別于各個(gè)修復(fù)期即再灌注1天(I25R1d)、3天(I25R3d)、5天(I25R5d)、7天(I25R7d)處死動(dòng)物，留取腎皮質(zhì)組織并提取組織總RNA。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)并分析miR-17-5p在急性腎損傷不同階段的表達(dá)變化。
　　(2)體外細(xì)胞模型:培養(yǎng)近端腎小管上皮細(xì)胞系RPTC。采用物理性缺氧模型(Hypoxia)及化學(xué)性缺氧模型（疊氮化鈉，Sodium Azide）。H

8、ypoxia模型組，給予1％氧培養(yǎng)細(xì)胞，分別于0小時(shí)(0h)、6小時(shí)(6h)、12小時(shí)(12h)、24小時(shí)(24h)、36小時(shí)(36h)、48小時(shí)(48h)收集細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA。Sodium Azide模型組，給予1 mol/L Sodium Azide培養(yǎng)細(xì)胞3小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液復(fù)氧處理，分別于復(fù)氧1小時(shí)(1h)、2小時(shí)(2h)、3小時(shí)(3h)收集細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行Real-timePCR檢測(cè)并分析miR-17-5

9、p在AKI不同體外模型中的表達(dá)變化。
　　2、miR-17-5p生物學(xué)功能體外實(shí)驗(yàn):采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染miR-17-5p寡核苷酸抑制探針（anti-miR-17-5p-LNA）或內(nèi)源性miR-17-5p模擬物(miR-17-5p mimic)入RPTC細(xì)胞，制備體外缺氧模型，分別采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析及Hoechst染色法觀察細(xì)胞凋亡率，并收集細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，采用Immunoblotting技術(shù)分析凋亡標(biāo)志物caspase-3裂解。<

10、br>　　3、下游機(jī)制研究:通過(guò)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-17-5p下游靶基因，初步選定多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)一致且存在多個(gè)物種保守序列的靶基因死亡受體6(Death Rceptor6，DR6)進(jìn)行下一步體內(nèi)、體外驗(yàn)證:雄性C57BL/6小鼠給予雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉25分鐘，再灌注1d，3d，5d，7d，留取腎臟皮質(zhì)提取總蛋白，采用immunoblotting分析DR6變化。構(gòu)建含有miR-17-5p綁定序列的DR63'UTR熒光素酶表達(dá)載體，并與miR

11、-17-5pmimic或無(wú)效序列（scrambled sequence oligonucleotide）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性變化;進(jìn)一步構(gòu)建DR6基因下調(diào)RPTC細(xì)胞系制備缺氧模型，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白采用immunoblotting檢測(cè)DR6變化，并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析及Hoechst染色法觀察細(xì)胞凋亡率。
　　4、上游機(jī)制研究:通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-17-5p上游可能的調(diào)控機(jī)制，初步分析獲得轉(zhuǎn)錄因子P53與mi

12、R-17-5p宿主基因的可能調(diào)控位點(diǎn)，并采用染色質(zhì)免疫共沉淀法(ChIP)證實(shí)其綁定調(diào)控關(guān)系。進(jìn)一步進(jìn)行體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　(1)體外實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)RPTC細(xì)胞，給予特異性p53通路抑制劑(pifithrin-α)干預(yù)后制備缺氧模型，采用Real-time PCR分析miR-17-5p表達(dá)的變化。構(gòu)建顯性失活突變體p53(Dominant-negative p53，DN-P53)過(guò)表達(dá)RPTC細(xì)胞系，制備缺氧模型后Immunob

13、lotting分析p53及DN-P53變化，Real-time PCR分析miR-17-5p表達(dá)變化。
　　(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):繁育并鑒定腎臟近端腎小管p53野生型(PT-P53-WT)和敲除型小鼠(PT-P53-KO)，給予雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉30分鐘松夾再灌注48小時(shí)(I30R48h)處理，留取小鼠血標(biāo)本測(cè)尿素氮(BUN)、血肌酐(sCr)，提取腎臟皮質(zhì)蛋白及RNA，immunoblotting檢測(cè)p53變化，Real-time PCR

14、分析miR-17-5p表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、miR-17-5p在急性腎損傷非修復(fù)動(dòng)物模型損傷晚期表達(dá)明顯上調(diào)，在急性腎損傷伴修復(fù)動(dòng)物模型各個(gè)時(shí)期均有上調(diào)，體外模型中，miR-17-5p于缺氧6小時(shí)出現(xiàn)微弱上調(diào)，24小時(shí)上調(diào)最明顯;而化學(xué)性缺氧不能誘發(fā)miR-17-5p表達(dá)上調(diào)。
　　2、miR-17-5p表達(dá)上調(diào)可以明顯抑制缺氧誘發(fā)的RPTC細(xì)胞凋亡，而外源性抑制miR-17-5p的表達(dá)則使RPTC細(xì)胞對(duì)缺氧

15、刺激耐受下降，凋亡增加。
　　3、小鼠腎臟缺血25分鐘再灌注1天后，DR6在腎臟皮質(zhì)組織中的表達(dá)即明顯減少，并且持續(xù)一周。內(nèi)源性miR-17-5p模擬物可以顯著抑制RPTC細(xì)胞中DR6的表達(dá)，相反miR-17-5p寡核苷酸抑制探針則解除miR-17-5p對(duì)DR6的抑制作用。通過(guò)構(gòu)建含miR-17-5p在DR63'非翻譯區(qū)(3'UTR)綁定序列的熒光素酶表達(dá)載體證實(shí)DR6為miR-17-5p下游直接靶基因。而DR6基因下調(diào)的RPTC

16、也對(duì)缺氧的耐受增強(qiáng)，凋亡明顯減少。
　　4、miR-17-5p兩個(gè)宿主基因miR-17-1及miR-17-2啟動(dòng)子區(qū)均存在p53調(diào)控位點(diǎn)，通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀法證實(shí)在缺氧條件下p53通過(guò)其調(diào)控序列誘導(dǎo)miR-17-5p表達(dá)。P53通路抑制劑可以顯著抑制p53表達(dá)，從而抑制miR-17-5p在缺氧條件下的上調(diào)。同時(shí)，過(guò)表達(dá)抑制p53基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的顯性失活突變體RPTC細(xì)胞中，缺氧條件不能誘發(fā)miR-17-5p表達(dá)上調(diào)。P53近端