MicroRNA在系統性硬皮病發(fā)病中的作用研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 系統性硬皮?。⊿Sc）是一種病因不明、發(fā)病機制尚不明確、涉及多因素的復雜性疾病，臨床上主要以皮膚和內臟器官纖維化、血管異常病變和免疫系統異常為主要特點的自身免疫性結締組織病。其中纖維化是系統性硬皮病發(fā)病過程中最突出的特點，也是嚴重影響病人生活質量、甚至危及病人生命的主要威脅。在以往的研究中，系統性硬皮病的發(fā)病機理主要涉及纖維化、血管病變、免疫系統異常、雙胞胎研究、遺傳、種族、嵌合體等多個方面，也涉及了基

2、因芯片、蛋白芯片等技術在基因組范圍內進行研究，但均未能成功的解釋其發(fā)病機理。
　　 MircoRNAs (miRNAs)是存在于許多生物體內長約18～25 nt的一類短序列、非編碼、具調控功能的單鏈小分子RNA，幾乎參與所有生命過程中一系列的重要進程，包括早期發(fā)育，細胞增殖、分化與凋亡，物質代謝等。目前已經明確，miRNAs是通過與其靶mRNA分子的3′端非編碼區(qū)(3′-UTR) 互補結合，在翻譯水平上特異性抑制基因表達，在許多

3、疾病的發(fā)病中扮演著重要角色。mircoRNA 芯片是近年來出現的發(fā)展比較成熟的高通量基因芯片技術，能在特定的時間點篩選出患者與正常人之間的差異microRNA表達情況，已在不少復雜性疾病的研究中得到了廣泛的應用，特別是惡性腫瘤的研究中應用最為廣泛。目前多個研究已經證實microRNA與腫瘤的發(fā)病、轉移、復發(fā)以及銀屑病、系統紅斑狼瘡、惡性黑素瘤等疾病的發(fā)病密切相關，并找到了疾病特異性microRNA，如miR-203是銀屑病特異性micr

4、oRNA，miR-140與骨肉瘤密切相關等。SSc作為一種復雜性自身免疫性疾病，與腫瘤、銀屑病、系統紅斑狼瘡有類似的地方，因此，我們推測在其發(fā)病機制中很可能也有其發(fā)病相關的microRNA。
　　 本研究用microRNA 芯片技術和生物信息學的方法，在國內外首次對系統性硬皮病患者皮損和正常人皮膚中的差異microRNA 進行分析篩選，并對篩選結果進行初步的分析和預測，以期獲得與系統性硬皮病發(fā)病關系密切相關或特異性的microR

5、NA，為進一步研究microRNA在系統性硬皮病發(fā)病中的分子機制、發(fā)現新的診斷標記與治療靶點提供重要參考。二、對象與方法將研究對象分為SSc組和對照組。SSc組的納入標準為：符合美國風濕病學會關于系統性硬皮病的診斷標準、發(fā)病較早（<2年）且未經過長期系統激素治療（激素應用<3個月）、有全身皮膚的硬化及肺纖維化的證據但臨床癥狀不明顯的患者，正常對照組為包皮環(huán)切患者的皮膚或良性皮膚痣切除術患者邊緣的正常皮膚；分別切取足量皮膚，提取總RNA，

6、分離microRNA 并進行熒光標記；然后進行雜交、清洗，之后進行microRNA芯片掃描；掃描結果用LuxScan3.0圖像分析軟件和SAM2.1軟件進行差異microRNA的分析篩選；Real-time PCR 方法隨機驗證篩選出的差異表達microRNA，以確保芯片結果的可靠性。
　　 生物信息學分析過程：首先，建立重點靶基因篩選庫；其次，在microRNA 數據庫中（TargetScan 數據庫）進行其靶基因（mRNA）

7、的搜索獲得其功能注釋；第三，將搜索到的靶基因與重點靶基因篩選庫的基因進行比對，挑選出功能上與細胞外基質（ECM）、纖維化、血管異常、免疫異常等相關以及存在于重點靶基因篩選庫中的基因，作為重點靶基因；第四，登錄NCBI 網站，將重點靶基因與SSc 輸入NCBI 進行檢索，檢索式：“SSc and 重點靶基因”；然后閱讀檢索出的文獻，分析其是否與SSc 發(fā)病相關；
　　 如有多個（≧5個）由同一個miRNA 調節(jié)的靶基因與SSc 發(fā)

8、病相關，那么就可以初步預測出該miRNA與SSc的發(fā)病相關；
　　 生物信息學方法查詢出差異表達microRNA 所調節(jié)的靶mRNA，PubMed上檢索出目前已發(fā)表文獻中與系統性硬皮病發(fā)病相關的靶mRNA，即可初步預測出該microRNA與系統性硬皮病的發(fā)病相關。
　　 三、結果
　　 1．我們首次從系統性硬皮病患者皮損中篩選出24個差異表達microRNA，其中9個microRNA表達上調， 15個microR

9、NA表達下調；并隨機抽取三個microRNA——has-let-7g, has-miR-206和has-miR-125b，用Real-time PCR的方法進行可靠性驗證，驗證結果與芯片分析結果一致，表明芯片結果可靠；
　　 2．通過生物信息學（www.gogene.org，目前該網站在維護中，不能打開，可以通過http://www.targetscan.org 進行microRNA靶mRNA的查詢）和文獻分析（http://w

10、ww.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）發(fā)現有6個差異表達的microRNA 其調節(jié)的靶基因與SSc的發(fā)病相關，其中has-miR-206 調控的584 條靶基因中有7 條與SSc 發(fā)病密切相關；has-let-7g 調控的819 條靶基因中有24 條與SSc 發(fā)病密切相關；has-miR-133a 調控的502 條靶基因中有12 條與SSc 發(fā)病密切相關；has-miR-125b 調控的604 條靶基因中有8 條與SS

11、c 發(fā)病密切相關；has-miR-140-5p 調控的251條靶基因中有7 條與SSc 發(fā)病密切相關；has-miR-23b 調控的480條靶基因中有14 條與SSc 發(fā)病密切相關。
　　 四、結論
　　 1．microRNA不僅參與了系統性硬皮病的發(fā)病過程，而且可能在系統性硬皮病的發(fā)病中扮演著重要的角色；
　　 2．Has-miR-206等6個miRNA與SSc 發(fā)病密切相關，并很可能在SSc的發(fā)病中起著較為重