雌二醇在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用.pdf

1、本文采用切除卵巢的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic erythematosus lupts，SLE)模型鼠作為研究對(duì)象，以減少內(nèi)源性雌激素的干擾，通過(guò)人工注射苯甲酸雌二醇控制體內(nèi)E2的水平，觀察其對(duì)SLE發(fā)生發(fā)展的影響。觀察了不同水平的E2對(duì)SLE模型小鼠腎臟局部芳香酶mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討E2可否通過(guò)調(diào)節(jié)芳香酶的活性影響SLE的病理過(guò)程。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、SLE小鼠模型的制備和脾細(xì)胞凋亡及相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究

2、 1、脾細(xì)胞懸液的制備無(wú)菌取Balb/c小鼠脾臟制備脾細(xì)胞懸液，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×10<'6>/ml，加入ConA，使其終濃度為5μg/ml。將加有ConA的脾細(xì)胞懸液置37℃、5％CO<,2>培養(yǎng)箱內(nèi)孵育12h后，收集活化脾細(xì)胞并以生理鹽水調(diào)節(jié)脾細(xì)胞濃度為2×10<'8>/ml，同樣條件制備未用ConA刺激的脾細(xì)胞懸液作為對(duì)照。 2、動(dòng)物分組及處理取72只小鼠隨機(jī)分為3組，每組2

3、4只： (1)SLE模型誘導(dǎo)組(model induced group，MI組)取ConA刺激活化的脾細(xì)胞5×10<'7>/只皮下注射，每周1次，連續(xù)3次。 (2)脾細(xì)胞對(duì)照組(cell control grotlp，CC組)給正常小鼠在相同時(shí)間、相同部位注射相同劑量的未經(jīng)ConA活化的同系脾細(xì)胞懸液。 (3)正常對(duì)照組(normal control grollp，NC組)給正常小鼠在相同時(shí)間、相同部位注射相同體

4、積的生理鹽水。 3、SLE模型鼠的鑒定 (1)樣品的收集于初次免疫后第4wk、第6wk、第8wk和第10wk，每組分別取出6只小鼠，用乙醚麻醉后摘除眼球采血，析出血清用于自身抗體ANA和AHA的測(cè)定。無(wú)菌取出雙側(cè)腎臟，分為3部分，第1部分離體后立即置于液氮中，用于制備冰凍切片進(jìn)行直接熒光抗體檢測(cè)；第2部分切取1mm<'3>腎皮質(zhì)置于3％戊二醛固定液中固定，用作制備超薄切片進(jìn)行透射電鏡觀察；第3部分腎組織置于10％甲醛中固

5、定，用于制備石蠟切片進(jìn)行HE染色。 (2)SLE模型鼠外周血中ANA、AHA的測(cè)定采用ELISA法檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 (3)SLE模型鼠腎臟病理改變的觀察。 ①光學(xué)顯微鏡觀察腎臟形態(tài)學(xué)的變化：常規(guī)制備小鼠腎組織石蠟切片，HE染色，用中性樹(shù)脂封固，光學(xué)顯微鏡下觀察并對(duì)腎小球病理學(xué)改變的嚴(yán)重程度進(jìn)行打分。 ②熒光顯微鏡觀察腎臟IgG類IC的沉積：采用直接免疫熒光法，簡(jiǎn)述如下：無(wú)菌取小鼠腎臟進(jìn)行冰凍切片

6、，滴加羊抗小鼠FITC-IgG抗體于組織切片上，置37℃孵育30min，在熒光顯微鏡下觀察腎小球內(nèi)有無(wú)IgG沉積及分布部位、熒光強(qiáng)度。 ③電子顯微鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)的改變：腎臟經(jīng)3％戊二醛磷酸預(yù)固定、1％鋨酸后固定、812環(huán)氧樹(shù)脂包埋、超薄切片、電子染色后，透射電鏡觀察腎小球基底膜、足突的變化及有無(wú)電子致密物沉積。 4、SLE模型鼠脾細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)第4wk，無(wú)菌取小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，PBS洗滌并調(diào)節(jié)

7、細(xì)胞密度為2×10<7>/ml，取細(xì)胞懸液進(jìn)行涂片，4％多聚甲醛固定后采用Tunel試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用NIS．Elements BR2．30圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率。 5、SLE模型鼠脾細(xì)胞Bcl-2和NFkB的檢測(cè) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法，簡(jiǎn)述如下：脾細(xì)胞收集及細(xì)胞涂片固定同上(4、SLE模型鼠脾細(xì)胞凋亡的檢測(cè))，3％H<,2>O<,2>去離子水3

8、7℃5min以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，分別滴加1：200稀釋的一抗(兔抗鼠Bcl-2和鼠抗鼠NF kB)50μl，4℃過(guò)夜，PBS洗滌后，再分別滴加相應(yīng)的酶標(biāo)二抗(抗兔和抗鼠)1滴，30℃ 25min，洗滌后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并拍照，采用圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率。 二、E2對(duì)Balb/c小鼠SLE模型誘導(dǎo)的影響 1、動(dòng)物分組及處理Balb/c近交系小鼠168只，隨機(jī)分為7組

9、，每組24只。 A組：假手術(shù)對(duì)照組，切除雙側(cè)卵巢周?chē)膬尚K脂肪作對(duì)照；B組：手術(shù)對(duì)照組，進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除作對(duì)照；C組：假手術(shù)模型組，假手術(shù)后進(jìn)行SLE模型誘導(dǎo)；D組：手術(shù)模型組，雙側(cè)卵巢切除后進(jìn)行SLE模型誘導(dǎo)；E組：E2小劑量組；F組：E2中劑量組；G組：E2大劑量組。E組、F組和G組小鼠切除雙側(cè)卵巢后，進(jìn)行SLE模型誘導(dǎo)，并且分別肌肉注射E2 0.1 μg/小鼠、1μg/小鼠和10 μg/小鼠，隔日1次，直至開(kāi)始相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。A、

10、B、C、D組小鼠隔日肌肉注射相當(dāng)于E2容量的花生油作對(duì)照。 2、樣品的收集于初次細(xì)胞免疫后第4wk、第6wk、第8wk和第10wk，每組分別取出6只小鼠用乙醚麻醉，摘除眼球取血，析出血清，用于ANA、AHA及E2測(cè)定。無(wú)菌取腎臟，分為4部分，第1部分腎組織每100mg加入0.5ml PBS液體勻漿，離心后取上清，用于測(cè)定腎組織E2。第2部分取1mm<'3>腎皮質(zhì)加入3％的戊二醛磷酸固定液中固定，用于電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)的改變。第

11、3部分迅速凍于液氮，后移至-70℃保存，用于制備冰凍切片進(jìn)行直接熒光抗體法檢測(cè)IgG類IC的沉積。第4部分于10％甲醛中固定，進(jìn)行石蠟切片HE染色。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、SLE小鼠模型的制備和脾細(xì)胞凋亡及相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MI組24只小鼠外周血中均出現(xiàn)ANA和AHA，腎臟發(fā)生病理學(xué)改變，而CC和NC組小鼠外周血中未檢出自身抗體，腎組織完好。具體檢測(cè)結(jié)果如下： 1、SLE模型鼠外周血中ANA和AHA水平的變化

12、MI組小鼠外周血中出現(xiàn)ANA和AHA，自身抗體自第1次接種活化脾細(xì)胞后第4wk出現(xiàn)，且逐漸升高，到第10wk開(kāi)始下降。而CC和NC組小鼠外周血中中未測(cè)得ANA和AHA。 2、SLE模型鼠腎臟病理的改變 (1)光學(xué)顯微鏡下腎臟形態(tài)學(xué)的變化MI組小鼠出現(xiàn)腎小球腎炎的表現(xiàn)，炎性改變程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而加劇，而CC組和NC組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)異常病理改變。 (2)熒光顯微鏡檢查IgG類IC沉積的變化腎臟冰凍切片直接熒光抗

13、體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MI組大多數(shù)腎小球內(nèi)都有被FITC著色的斑塊狀沉積物，可見(jiàn)腎小球毛細(xì)血管襻免疫復(fù)合物沉積，呈連續(xù)性熒光分布，隨著活化脾細(xì)胞免疫時(shí)間延長(zhǎng)，可見(jiàn)腎臟冰凍切片熒光滴度增強(qiáng)。而CC組和NC組小鼠腎臟未見(jiàn)IgG類免疫復(fù)合物的沉積，直接熒光染色微弱、無(wú)特異性，腎小球輪廓不清。 (3)電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)的變化MI組小鼠腎小球?yàn)V孔膜融合，內(nèi)皮細(xì)胞脫落，系膜細(xì)胞插入基膜，基膜厚度彌漫不均，可見(jiàn)基膜區(qū)有電子致密物沉積。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MI組小鼠

14、第10wk腎臟超微結(jié)構(gòu)改變最嚴(yán)重。CC組和NC組基底膜厚度均勻，濾過(guò)屏障結(jié)構(gòu)完好，未見(jiàn)電子致密物沉積。 3、SLE模型鼠脾細(xì)胞凋亡的變化與NC組和CC組相比較，MI組初次免疫后第4wk，其脾細(xì)胞凋亡百分率(0.89±0.23)明顯降低。 4、SLE模型鼠脾細(xì)胞Bcl-2和NFKappaB表達(dá)的改變與NC組和CC組相比較，MI組脾細(xì)胞Bcl-2和NF kB的表達(dá)細(xì)胞百分率(分別為89.78±7.62和52.12±8.87)

15、明顯增高。 二、E2對(duì)Balb/c小鼠SLE模型誘導(dǎo)的影響。 1、SLE模型鼠外周血中及腎組織E2水平的變化B組外周血中E2水平明顯降低，與A組相比較差異顯著(P<0.01)。但B組外周血中E2隨著時(shí)間逐漸升高，第10wk與第4wk相比較有明顯差異(p<0.01)。C組和D組外周血中E2的水平分別高于A組和B組(P<0.01)，說(shuō)明SLE炎癥狀態(tài)下，外周血中E2水平升高。E、F、G組相當(dāng)于超過(guò)機(jī)體生理水平的3個(gè)劑量組，由

16、于激素在體內(nèi)的累積作用，無(wú)論血中，還是腎組織中E2均逐漸升高。3組外周血中E2水平在第4wk、第6wk、第8wk和第10wk兩兩差異均非常顯著(P<0.01)。小鼠腎組織E2的變化與外周血中E2水平的變化基本保持一致，但是腎組織E2明顯低于外周血中E2。 2、E2對(duì)SLE模型鼠外周血中ANA和AHA產(chǎn)生的影響經(jīng)同系活化脾細(xì)胞免疫的Balc/b小鼠外周血中均出現(xiàn)ANA和AHA，C組和D組自身抗體在第8wk達(dá)到最高峰，然后降低，符合

17、典型免疫應(yīng)答的過(guò)程。而肌肉注射E2的E組、F組和G組到第10wk仍未見(jiàn)自身抗體的降低，可見(jiàn)E2是自身抗體產(chǎn)生的明顯的促進(jìn)因素，這可能是女性育齡多發(fā)SLE的一個(gè)重要原因。A組及B組小鼠外周血中均未檢出ANA和AHA。 研究結(jié)論： 1、采用ConA活化的同系脾細(xì)胞成功地誘導(dǎo)了Balb/c小鼠SLE動(dòng)物模型； 2、脾細(xì)胞凋亡抑制可能是ConA活化的同系脾細(xì)胞誘導(dǎo)Balb/c小鼠SLE的始動(dòng)因素； 3、NF kB