Tfh和Breg細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用及MSC對(duì)其調(diào)控研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種累及全身多器官、多系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病，多發(fā)于育齡期婦女，我國(guó)的發(fā)病率遠(yuǎn)高于國(guó)外。SLE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前未完全闡明，但明確的是免疫系統(tǒng)的失調(diào)和紊亂參與了SLE的發(fā)病及后續(xù)的多系統(tǒng)累及。因此，深入揭示SLE發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制，對(duì)尋找新的治療靶點(diǎn)和治療方法，進(jìn)一步提高SLE的臨床治療水平具有重要的意義。
　　濾泡輔助T細(xì)胞(Tfh)是一群近年來發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞，主要分泌IL-21，

2、傳統(tǒng)認(rèn)為其功能以輔助效應(yīng)性B細(xì)胞分化、成熟及分泌抗體為主，在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，研究表明狼瘡中Tfh細(xì)胞比例增加，但Tfh細(xì)胞的增加與狼瘡病情活動(dòng)的關(guān)系目前無相關(guān)報(bào)道。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg)是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞，在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)、炎癥性腸病(IBD)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)等動(dòng)物模型中具有重要的免疫抑制作用。但Breg細(xì)胞在SLE中作用，目前研究結(jié)果不盡相同。狼瘡體內(nèi)Breg細(xì)胞

3、的比例如何，與病情活動(dòng)度有無相關(guān)性，且Tfh細(xì)胞是否對(duì)Breg細(xì)胞具有輔助作用，其可能的輔助機(jī)制如何，目前國(guó)內(nèi)外尚無明確報(bào)道。
　　此外，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)近年來作為狼瘡治療的新方法，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床中取得了初步的療效，其作用機(jī)制主要通過分泌抑制性的細(xì)胞因子或細(xì)胞接觸抑制發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但MSC是否能通過調(diào)節(jié)Tfh和Breg細(xì)胞來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用目前無明確結(jié)論，有待進(jìn)一步的研究。
　　研究目的：
　　第一部分:明

4、確SLE患者外周血中Tfh和Breg細(xì)胞比例的變化，分析Tfh和Breg細(xì)胞間的相關(guān)性，及與SLE病情活動(dòng)的相關(guān)性;
　　第二部分:探討MRL/Ipr狼瘡鼠中Tfh和Breg細(xì)胞比例變化和狼瘡病情活動(dòng)的相關(guān)性;
　　第三部分:明確Tfh細(xì)胞及其分泌的IL-21對(duì)Breg細(xì)胞分化的調(diào)控作用和機(jī)制;
　　第四部分:明確MSC輸注對(duì)MRL/Ipr狼瘡鼠的治療作用，及對(duì)Tfh和Breg細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　研究?jī)?nèi)容與方法

5、：
　　第一部分
　　熒光顯微鏡下檢測(cè)SLE患者外周血中是否存在Tfh和Breg細(xì)胞;免疫組化檢測(cè)SLE皮損組織中IL-10陽性B細(xì)胞的浸潤(rùn)情況;流式細(xì)胞儀檢測(cè)30例SLE患者和15例正常對(duì)照外周血中Tfh和Breg細(xì)胞的比例，并分析兩者的相關(guān)性;實(shí)時(shí)定量RT-PCR(real-time RT-PCR)檢測(cè)Tfh和Breg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)SLE患者血清中IL-21、

6、IL-10、ds-DNA和ANA的濃度;結(jié)合臨床SLEDAI評(píng)分分析SLE中Tfh和Breg兩群細(xì)胞間的相關(guān)性及與SLE病情活動(dòng)的關(guān)系。
　　第二部分
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)MRL/Ipr狼瘡鼠脾細(xì)胞中Tfh和Breg細(xì)胞的比例;real-timeRT-PCR檢測(cè)Tfh和Breg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá);ELISA檢測(cè)外周血清中ds-DNA、ANA、IL-21、IL-10的濃度;免疫組化檢測(cè)脾臟生發(fā)中心(GC)的

7、變化，及IL-21和IL-10在脾臟中的表達(dá);分析Tfh和Breg兩群細(xì)胞間的相關(guān)性及與狼瘡病情活動(dòng)的關(guān)系。
　　第三部分
　　從小鼠脾細(xì)胞中分選Tfh細(xì)胞，體外培養(yǎng)后收集上清備用;分選小鼠脾臟Na(i)ve B細(xì)胞，體外培養(yǎng)時(shí)加入上一步收集的Tfh細(xì)胞培養(yǎng)上清，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天后流式細(xì)胞儀檢測(cè)Breg細(xì)胞的比例，ELISA檢測(cè)上清中IL-10的濃度;IL-21體外直接作用于小鼠Na(i)ve B細(xì)胞，研究IL-21對(duì)Bre

8、g細(xì)胞分化和IL-10分泌的影響;同時(shí)研究IL-21對(duì)Breg細(xì)胞分化過程中STAT3活化的影響，并通過阻斷JAK和p-STAT3的活化，明確JAK-STAT3信號(hào)通路在IL-21介導(dǎo)的Breg細(xì)胞分化過程中的作用;并進(jìn)一步研究IL-21誘導(dǎo)的Breg細(xì)胞的免疫抑制作用。
　　第四部分
　　體外全骨髓貼壁法分離B6鼠來源的MSC，經(jīng)體外培養(yǎng)及純化細(xì)胞至第四代(P4)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面的8種標(biāo)志。MSC與脾細(xì)胞共培養(yǎng)后流式

9、細(xì)胞儀檢測(cè)MSC對(duì)Tfh和Breg細(xì)胞分化的影響，MSC與體外分選的CD4+T細(xì)胞及CD19+B細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)MSC的對(duì)T、B淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。分離純化的MSC經(jīng)尾靜脈注射入MRL/Ipr狼瘡鼠體內(nèi)，繼續(xù)飼養(yǎng)8周后檢測(cè)狼瘡鼠的病情變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSC輸注治療后MRL/Ipr狼瘡鼠脾細(xì)胞中Tfh和Breg細(xì)胞比例的變化。
　　研究結(jié)果
　　第一部分
　　1、SLE患者外周血中存在循環(huán)的Tfh和B

10、reg細(xì)胞，兩群細(xì)胞比例增多并呈正相關(guān)，SLE皮損中IL-10陽性的B細(xì)胞增加;
　　2、SLE患者外周血中Tfh分泌的IL-21和Breg分泌的IL-10的基因表達(dá)和蛋白分泌都增加，IL-21不僅與自身抗體分泌相關(guān)，且與IL-10濃度的增加呈正相關(guān)。
　　第二部分
　　1、MRL/Ipr狼瘡鼠脾臟增生明顯，脾細(xì)胞中Tfh和Breg細(xì)胞的比例擴(kuò)增，相關(guān)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)增加;
　　2、脾臟中Tfh細(xì)胞

11、不與生發(fā)中心形成、自身抗體分泌及狼瘡發(fā)病相關(guān)，與Breg細(xì)胞的擴(kuò)增也密切相關(guān)僅。
　　第三部分
　　1、Tfh細(xì)胞分泌的IL-21能促進(jìn)Breg細(xì)胞的體外分化和IL-10的分泌;IL-21能以時(shí)間和劑量依賴的方式促進(jìn)Breg細(xì)胞分化和IL-10的分泌;
　　2、IL-21通過誘導(dǎo)STAT3的磷酸化進(jìn)而促進(jìn)Breg細(xì)胞的分化和IL-10的分泌，阻斷JAK-STAT3信號(hào)通路能抑制IL-21介導(dǎo)的Breg細(xì)胞分泌IL-10

12、;
　　3、IL-21誘導(dǎo)的Breg細(xì)胞具有明確的免疫抑制作用。
　　第四部分
　　1、小鼠骨髓來源的MSC分離純化到第四代時(shí)能獲得較高純度的MSC;
　　2、MSC在體外能抑制Tfh和Breg細(xì)胞的分化;
　　3、MSC治療MRL/Ipr狼瘡鼠后，能有效改善狼瘡鼠的病情進(jìn)展，抑制體內(nèi)Tfh和Breg細(xì)胞的分化。
　　研究結(jié)論
　　1、SLE患者外周血中存在擴(kuò)增的Tfh和Breg細(xì)胞，兩群細(xì)胞比

13、例增加并與SLE病情活動(dòng)相關(guān)，Tfh細(xì)胞的多克隆與Breg細(xì)胞的擴(kuò)增呈正相關(guān);
　　2、MRL/Ipr狼瘡鼠中Tfh和Breg細(xì)胞比例增加，Tfh與Breg細(xì)胞的擴(kuò)增呈正相關(guān);
　　3、Tfh細(xì)胞可通過分泌的IL-21誘導(dǎo)Breg細(xì)胞的分化和IL-10的分泌，IL-21可通過活化STAT3來促進(jìn)Breg細(xì)胞的分化;
　　4、MSC治療能有效改善狼瘡鼠的病情進(jìn)展，MSC可通過抑制狼瘡鼠體內(nèi)的Tfh細(xì)胞發(fā)揮治療作用，MSC